超高壓致大腸桿菌O157-H7損傷后的修復機理研究.pdf

1、超高壓技術(shù)作為一種非熱殺菌技術(shù)，已成為控制食品中大腸桿菌O157∶H7等食源性致病菌的有效手段。然而，研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理可導致細菌產(chǎn)生亞致死損傷，由于菌體特性改變導致其在常規(guī)檢測中易被低估或忽視，故亞致死損傷菌的存在給食品的安全及貨架期帶來潛在風險。前入較多研究超高壓對微生物的致死效應，而對超高壓誘導微生物損傷后的修復研究少見報道，因此本論文旨在研究超高壓損傷的大腸桿菌O157∶H7在無營養(yǎng)的磷酸鹽緩沖液PBS中的修復情況。本論文首先采

2、用不同壓強對大腸桿菌O157∶H7進行超高壓處理，確定出產(chǎn)生損傷菌較多的超高壓條件，接著對此條件下所產(chǎn)生的損傷菌以PBS為基質(zhì)于不同溫度下進行修復，確定亞致死損傷菌的最佳修復條件;進而，在最佳修復條件下研究修復過程中損傷菌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、生理特征分析、基因表達的變化等來闡明大腸桿菌O157∶H7超高壓損傷后的修復機理。本研究將為實際生產(chǎn)加工中超高壓的科學合理使用提供依據(jù)，為超高壓處理后的安全貯藏提供風險評估手段。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:<

3、br>　　1、損傷的大腸桿菌O157∶H7不同溫度下的修復曲線
　　大腸桿菌O157∶H7分別采用100、200、300、400、500 MPa(25℃、5 min)進行超高壓處理，采用選擇性培養(yǎng)基SMAC和非選擇性培養(yǎng)基TSA進行傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，結(jié)果表明，隨著壓強升高，滅活效果越好，但是損傷效應與致死效應并不一致。大腸桿菌O157∶H7在400 MPa條件下處理5 min，亞致死損傷率最高。進一步將400 MPa超高壓處理后的大腸

4、桿菌O157∶H7分別置于20、25、30、37℃下，以PBS作為基質(zhì)進行修復研究，結(jié)果表明隨著修復時間延長，損傷菌分別在60h(20℃)、24h(25℃)、36h(30℃)、48 h(37℃)基本修復，最終確定損傷的大腸桿菌O157∶H7的最適修復溫度為25℃，修復24 h時基本完成修復。
　　2、損傷的大腸桿菌O157∶H7修復過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)變化
　　在上述實驗基礎上，400 MPa超高壓損傷的大腸桿菌O157∶H7在無

5、營養(yǎng)基質(zhì)PBS中25℃修復24 h，采用掃描電鏡和透射電鏡觀察超高壓損傷菌在不同修復階段下表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。掃描電鏡結(jié)果表明，超高壓可導致菌體表面凹陷、細胞膜破裂、變形等形態(tài)異常，但隨著修復時間延長，損傷菌表面逐漸變光滑，修復18h、24 h后菌體形態(tài)顯著改善，最終基本恢復為正常菌。透射電鏡結(jié)果表明，超高壓可導致菌體細胞變形、質(zhì)壁分離、細胞內(nèi)出現(xiàn)光透明區(qū)、細胞膜破裂等變化，但隨著修復時間延長，細胞質(zhì)分布均勻，透明區(qū)域逐漸消失，至

6、實驗末期損傷菌的結(jié)構(gòu)基本恢復為正常菌。
　　3、損傷的大腸桿菌O157∶H7修復過程中生理特性的變化
　　400 MPa超高壓損傷的大腸桿菌O157∶H7在PBS中25℃修復24 h，研究超高壓損傷菌在不同修復階段下Na+、K+、Ca2+、Mg2+離子外泄量、細胞膜Na+K+-ATP酶活性和Ca2+Mg2+-ATP酶活性、細胞膜通透性、可溶性膜蛋白組成及膜脂肪酸組成等生理特性方面的變化。結(jié)果表明，超高壓處理可對大腸桿菌O15

7、7∶H7細胞膜生理特性造成嚴重破壞，各指標與未經(jīng)超高壓處理的對照組相比均具有顯著性差異(P＜0.05)。修復過程中，隨著修復時間延長，各離子外泄量、Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活性、細胞膜通透性、可溶性蛋白組成、脂肪酸組成的變化逐漸趨向正常細胞水平，表明損傷的菌體生理特性發(fā)生修復。實驗末期修復24 h時與正常未處理組仍存在顯著性差異(P＜0.05)，這主要與體系中存在一定量不可逆損傷和死亡細菌有關。
　　4、損

8、傷的大腸桿菌O157∶H7修復過程中差異基因的表達
　　采用Real-time PCR相對定量的方法分析400 MPa超高壓誘導大腸桿菌O157∶H7損傷后修復過程中熱休克蛋白相關基因DnaK、GroEL、ClpP、ClpA表達量變化。結(jié)果表明，超高壓處理后四種熱休克蛋白相關基因DnaK、GroEL、ClpP、ClpA表達量均顯著上升(p＜0.05)，修復過程中四種基因表達量仍逐漸上升，且修復后期顯著高于修復初期(p＜0.05)，