氧化還原敏感mPEG-PLGA-DTX結(jié)合物膠束的研究.pdf

1、癌癥死亡率與發(fā)病率逐年增高，已成為世界范圍內(nèi)的一大健康問題。多西他賽(docetaxel，DTX)是紫杉烷類抗癌藥，其作用機制是抑制微管蛋白解聚，從而阻斷腫瘤細胞增殖。多西他賽抗癌譜較廣，可以用來治療肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌，治療效果是紫杉醇的2-4倍。但是其水溶性較差，臨床注射液應(yīng)用吐溫80增溶，易引起毒副反應(yīng);其分布無特異性，易引起全身毒性。此外，由于紫杉烷類藥物的大量使用，導(dǎo)致癌癥細胞對紫杉烷類藥物產(chǎn)生了多藥耐藥(multi

2、-drug resistance，MDR)性，這成為DTX使用中的另一大問題。癌癥細胞產(chǎn)生耐藥性的主要原因是細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白p-glycoprotein(p-gp)的過量表達。
　　由于高分子科學的快速發(fā)展，應(yīng)用聚合物高分子作為藥物載體包載疏水性藥物以增加疏水藥物溶解性和治療效果的研究成為熱點。兩親性嵌段聚合物可以在水中聚集為膠束;膠束具有親-疏水核殼結(jié)構(gòu)，內(nèi)核疏水而外殼親水，其疏水內(nèi)核可以包載疏水性藥物。聚合物膠束可以通過物理性包

3、埋和化學結(jié)合兩種方式包載藥物?；瘜W結(jié)合載藥是將藥物和聚合物嵌段通過化學鍵化學結(jié)合形成聚合物-藥物結(jié)合物(polymer-drug conjugate)，藥物成為聚合物的一部分，參與膠束的組裝。此方法可以增加膠束的載藥量和穩(wěn)定性:還可利用環(huán)境敏感的化學鍵共價連接藥物和聚合物，起到在腫瘤部位集中釋放藥物，提高藥物療效的作用，這也是此類藥物傳遞系統(tǒng)的一大創(chuàng)新點。腫瘤組織內(nèi)具有較低的pH值，特殊酶和較強的還原性環(huán)境，基于此特點，可以采用pH敏感

4、、酶敏感和氧化還原敏感的化學鍵連接藥物，使聚合物具有環(huán)境敏感性質(zhì)。
　　本課題成功合成了具有氧化還原敏感的聚合物-藥物結(jié)合物，使其在水中自組裝，并進一步用于包載其他藥物。選擇兩親性聚合物甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯(mPEG-PLGA，PP)作為大分子骨架，通過氧化還原敏感的二硫鍵連接DTX，合成敏感的mPEG-PLGA-SS-DTX(PP-SS-DTX)結(jié)合物。利用此結(jié)合物進一步包載多西他賽或維拉帕米（verapamil，VR

5、P），實現(xiàn)載藥體系功能多樣化。
　　本課題研究包括以下幾個方面:
　　1、PP-SS-DTX結(jié)合物的合成和表征:選擇含有二硫鍵的二硫代二丙酸（即DTDP）作為連接分子，通過三步化學反應(yīng)成功合成了PP-SS-DTX結(jié)合物，并通過熔點測定、核磁共振氫譜(1H-NMR)和傅立葉變換紅外色譜(FT-IR)驗證其結(jié)構(gòu)。此外，通過芘探針法測定其臨界聚集濃度(critical aggregationconcentration，CAC)，發(fā)

6、現(xiàn)PP-SS-DTX結(jié)合物的CAC值很小，為10.20μmol/L。
　　2、氧化還原敏感型雙模式載多西他賽PP-SS-DTX/DTX膠束系統(tǒng)的評價:通過透析法制備雙模式載多西他賽PP-SS-DTX/DTX膠束，雙模式是指同一體系中通過化學結(jié)合和物理包埋兩種模式包載DTX。通過TEM和DLS測定膠束的形態(tài)和粒徑，所制備的PP-SS-DTX/DTX膠束呈球形，粒徑為112.3nm; PP-SS-DTX/DTX膠束具有較高的載藥量，為

7、（14.65±0.71）％。通過溶血試驗初步判斷PP-SS-DTX/DTX膠束具有一定生物相容性。為驗證PP-SS-DTX/DTX膠束釋藥是否具有氧化還原敏感性，在釋放介質(zhì)中加入還原型物質(zhì)DTT。釋放實驗結(jié)果表明，與DTX原料藥溶液相比，PP-SS-DTX/DTX膠束具有藥物緩釋、氧化還原敏感性釋藥和程序性釋藥的特點。選擇乳腺癌MCF-7細胞系和黑色素瘤B16F10細胞系進行體外細胞毒性實驗與細胞攝取實驗。在兩種細胞系中，PP-SS-D

8、TX/DTX膠束的毒性作用均明顯強于DTX溶液。由于DTX不能發(fā)熒光，利用香豆素-6(coumarin-6，C-6)模擬疏水藥物DTX，制備了PP-SS-DTX/C-6膠束，通過熒光倒置顯微鏡技術(shù)和流式細胞術(shù)定性、定量的研究細胞對PP-SS-DTX/C-6膠束的攝取。結(jié)果表明，MCF-7和B16F10兩種細胞對PP-SS-DTX/C-6膠束的攝取效率高于C-6溶液。細胞對膠束制劑的高攝取效率，保證了藥物濃集于病變細胞，是提高抗腫瘤效果的

9、重要原因。
　　3、PP-SS-DTX/VRP雙模式雙載藥膠束系統(tǒng)的抗腫瘤多藥耐藥的評價:采用探頭超聲法制備PP-SS-DTX/VRP膠束，雙模式是指分別通過化學結(jié)合和物理包埋方式載藥，雙載藥是指一個膠束體系同時包載兩種藥物——多西他賽和維拉帕米。維拉帕米是有效的p-gP的拮抗劑，可與p-gp結(jié)合并使其失活，逆轉(zhuǎn)癌癥細胞的多藥耐藥。
　　在制備膠束過程中，考察探頭超聲的超聲時間對維拉帕米的包封率與載藥量的影響，發(fā)現(xiàn)探頭超聲的

10、時間越短，維拉帕米的載藥量和包封率越高。通過TEM和DLS測定膠束的形態(tài)和粒徑，PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束均呈球形，粒徑分別為（79.3±1.2）nm和（78.3±4.6）nm。PP-SS-DTX/VRP膠束中DTX載藥量為（8.94±0.72）％，維拉帕米的載藥量為(5.66±1.60)％，包封率為（53.49±10.96）％。為驗證膠束的體外釋放是否具有敏感性，在釋放介質(zhì)中加入DTT，實驗發(fā)現(xiàn)DTX和VR

11、P的釋放均具有氧化還原敏感性。為研究膠束的抗腫瘤多藥耐藥的作用，選擇乳腺癌MCF-7細胞和耐藥的乳腺癌MCF-7/ADR細胞，進行DTX溶液、PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束的細胞毒性實驗、細胞攝取實驗和細胞凋亡實驗。細胞毒性實驗表明，PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束對兩種細胞系的細胞毒性作用均好于 DTX溶液;此外，PP-SS-DTX/VRP膠束對MCF-7/ADR細胞的細胞毒性作用強于PP

12、-SS-DTX膠束。由于DTX和VRP不能發(fā)熒光，因此選擇p-gp底物羅丹明123（rhodamine123，RH123）作為熒光分子對膠束進行標記研究細胞攝取情況和p-gp抑制效果。結(jié)果表明，MCF-7對PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束的細胞攝取效率相似，且均大于RH123溶液;MCF-7/人DR細胞對RH123幾乎無攝取，對PP-SS-DTX/VRP膠束的攝取大于對PP-SS-DTX膠束的攝取。細胞凋亡實驗表明

13、，PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束培養(yǎng)的細胞凋亡數(shù)目多于DTX溶液組。以上實驗結(jié)果表明，PP-SS-DTX包載VRP后，可以抑制p-gp的作用，增強耐藥細胞對膠束的攝取，加快細胞凋亡的進程，從而提高多西他賽的抗腫瘤效應(yīng)。
　　4、PP-SS-DTX膠束體內(nèi)藥動學研究:實驗動物選擇Wi star大鼠，通過尾靜脈注射給藥，利用HPLC法檢測大鼠血漿中DTX的含量。以DTX原料藥溶液作對照，觀察PP-SS-DTX膠

14、束的體內(nèi)藥動學過程，得到血藥濃度-時間曲線，并通過DSA2.0軟件對血藥濃度-時間曲線擬合，得PP-SS-DTX膠束房室模型和藥動學參數(shù)。將DTX制備成PP-SS-DTX膠束后，血藥濃度-時間曲線變平緩;通過對曲線擬合，發(fā)現(xiàn)DTX溶液和PP-SS-DTX膠束均符合二室模型。將DTX制備成PP-SS-DTX膠束后，體內(nèi)清除率降低，消除半衰期和體內(nèi)滯留時間延長，有利于藥物緩釋并保證藥物療效。
　　綜上所述，本研究首次合成了具有氧化還原