利用染色體不同整合位點(diǎn)構(gòu)建具有木糖代謝能力的重組釀酒酵母菌株.pdf

1、石油資源短缺及石油基產(chǎn)品，特別是以汽油和柴油為代表的車用燃料大量消費(fèi)導(dǎo)致的大氣污染，使發(fā)展生物燃料成為共識(shí)。燃料乙醇是目前產(chǎn)量最大的生物燃料，國內(nèi)外主要以糖質(zhì)和淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)，無法向更大規(guī)模發(fā)展，因此開發(fā)利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源生產(chǎn)燃料乙醇成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，但這類生物質(zhì)水解產(chǎn)生五碳糖的有效利用是木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵技術(shù)開發(fā)的瓶頸之一。
　　木糖是水解液中含量最高的五碳糖，本論文著眼于重組釀酒酵母木糖利用的研究，將畢赤酵母（Sch

2、effersomyces stipites）來源的木糖還原酶（PsXR）基因、木糖醇脫氫酶(PsXDH)基因和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）來源的木酮糖激酶(ScXK)基因和絮凝基因FLO1以不同組合方式、不同位點(diǎn)整合于工業(yè)釀酒酵母菌株染色體上，并利用蛋白質(zhì)工程手段獲得定點(diǎn)突變的PsXR基因，成功將其輔因子傾向性由NADPH改變?yōu)镹ADH，重點(diǎn)研究對(duì)木糖利用性能的影響。研究工作構(gòu)建了8株重組酵母菌株，包括2

3、株絮凝菌株，分別從關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄、酶活和混合糖發(fā)酵性能等方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，主要研究結(jié)果如下:
　　1.在染色體串聯(lián)整合方式中，PsXR、PsXDH和ScXK基因整合在工業(yè)釀酒酵母S.cerevisiae6525第16條染色體的YPRCdelta15位點(diǎn)，構(gòu)建得到的菌株分別為ZQ1（攜帶野生型PsXR基因）和ZQ2（攜帶突變型PsXR基因）。在染色體分散整合方式中，PsXR基因整合于酵母第16條染色體的YPRCdelta15位點(diǎn)，P

4、sXDH基因整合于酵母第16條染色體的YPRCtau3位點(diǎn)，ScXK基因整合于酵母第4條染色體的YIRCdelta6位點(diǎn)，構(gòu)建得到的菌株分別為ZQ3（攜帶野生型PsXR基因）和ZQ4（攜帶突變型PsXR基因）。PsXR、PsXDH基因使用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1p，而ScXK基因則使用中等強(qiáng)度表達(dá)的啟動(dòng)子ADH1p，三個(gè)基因均采用CYC1t作為終止子。
　　2.為了比較重組酵母ZQ1、ZQ2、ZQ3和ZQ4的木糖代謝能力，分別從木糖

5、代謝基因轉(zhuǎn)錄、酶活性、混合糖發(fā)酵性能等方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。攜帶經(jīng)過突變PsXR基因的ZQ2和ZQ4在發(fā)酵周期內(nèi)可以消耗完所有的木糖，消耗速率都是0.0035 g/g CDW/h，高于攜帶野生型PsXR基因的ZQ1和ZQ3。ZQ1的木糖消耗速率是0.0022 g/g CDW/h，而ZQ3的木糖消耗速率則與ZQ2、ZQ4的接近，大概在0.0033 g/g CDW/h。ZQ4產(chǎn)生的木糖醇比ZQ2降低了59％，ZQ3木糖醇產(chǎn)量為0.83 g/g，

6、ZQ1在沒有消耗完全部木糖的情況下仍然產(chǎn)生0.9 g/g的木糖醇。從兩種不同染色體整合方式的比較來看，攜帶有分散整合方式的重組菌株ZQ3和ZQ4的木糖代謝能力要高于攜帶串聯(lián)整合方式的重組菌株ZQ1、ZQ2，而且PsXR基因的輔因子改造有助于降低木糖醇的產(chǎn)生，同時(shí)提高木糖的代謝能力。
　　3.將含有PsXR、PsXDH和ScXK三個(gè)基因的串聯(lián)表達(dá)整合載體導(dǎo)入不同背景的工業(yè)釀酒酵母菌株中，檢測(cè)出發(fā)菌株遺傳背景對(duì)木糖代謝能力的影響。構(gòu)建

7、了重組釀酒酵母菌株ZQ1、ZQ5和ZQ7，分別來自工業(yè)釀酒酵母S.cerevisiae6525、4126和6508。從木糖代謝基因轉(zhuǎn)錄、酶活和混合糖發(fā)酵性能等方面對(duì)三株重組菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)ZQ5的三個(gè)木糖代謝基因具有最高的轉(zhuǎn)錄活性，分別為ZQ1中PsXR酶活的4.1倍，PsXDH酶活的6.2倍，ScXK酶活的4.3倍;為ZQ7中PsXR、PsXDH、ScXK酶活的3.6倍、4.6倍、2.7倍。同時(shí)重組菌株ZQ5也是三株菌株中混合糖發(fā)酵

8、能力最強(qiáng)的，在不同混合糖濃度條件下都可以完全消耗培養(yǎng)基中的木糖。ZQ1的混合糖發(fā)酵能力最弱，在40 g/L葡萄糖和20 g/L木糖濃度下，ZQ7的發(fā)酵能力優(yōu)于其余兩株菌株，在第4天可以消耗80％的木糖，而ZQ5只消耗了70％的木糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)不同宿主的遺傳背景對(duì)重組菌株代謝木糖的能力影響很大，說明重組木糖代謝途徑屬于宿主依賴性。在構(gòu)建重組木糖代謝途徑時(shí)，選擇優(yōu)良的宿主有利于改善木糖發(fā)酵效果。
　　4.為了提高重組酵母的脅迫耐受性