采用同源重組技術(shù)構(gòu)建PrA低表達(dá)且能分泌LTP1的釀酒酵母菌株及其性能研究.pdf

1、釀酒酵母蛋白酶A(PrA)〔EC3.4.23.25〕為釀酒酵母產(chǎn)生的一種酸性蛋白水解酶。純生啤酒采用低溫膜過濾除菌達(dá)到生物穩(wěn)定性，因而蛋白酶A的活性不被破壞。由于啤酒的pH值在4.3—4.4的酸性范圍內(nèi)，因此啤酒被消費(fèi)者消費(fèi)之前，蛋白酶A都會降解啤酒中的蛋白和多肽，尤其是當(dāng)啤酒中的泡沫陽性蛋白被蛋白酶A降解后會導(dǎo)致啤酒的泡沫衰減、泡持性降低。啤酒的泡沫性能是用來衡量啤酒質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。前人的研究結(jié)果證實(shí)啤酒中的大麥脂轉(zhuǎn)移蛋白1(LT

2、P1)是對啤酒泡沫穩(wěn)定性最為關(guān)鍵的蛋白，這種蛋白是底物特異性較小的酵母蛋白酶A的作用底物，這使得純生啤酒的泡沫衰減問題更加突出。
　　 為從根本上解決純生啤酒的泡沫衰減問題，本研究論文中從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因組中通過PCR分別擴(kuò)增得到了釀酒酵母乙醇脫氫酶啟動子(ADH1 promoter)、MFα1信號肽序列(MFα1s)、細(xì)胞色素C終止子序列(CYC1 terminator)等表達(dá)調(diào)

3、控DNA序列；從二棱大麥(Hordeum vulgare)基因組中擴(kuò)增得到了大麥脂轉(zhuǎn)移蛋白1(LTP1)的編碼序列，并構(gòu)建了釀酒酵母的大麥脂轉(zhuǎn)移蛋白1的表達(dá)盒。將遺傳霉素G418的抗性序列KanMX作為篩選標(biāo)記與大麥Ltp1表達(dá)盒共同克隆到質(zhì)粒YEplac181的多克隆位點(diǎn)中，得到釀酒酵母大麥LTP1分泌表達(dá)型質(zhì)粒YEp181—KAMLC。使用質(zhì)粒YEp181—KAMLC對釀酒酵母WZ65進(jìn)行轉(zhuǎn)化并使用釀酒酵母轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，采

4、用HPLC對大麥Ltp1表達(dá)盒的下游產(chǎn)物進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果表明，大麥脂轉(zhuǎn)移蛋白1在釀酒酵母菌株WZ65中得到了分泌表達(dá)，在發(fā)酵開始的24小時(shí)內(nèi)大麥脂轉(zhuǎn)移蛋白1的產(chǎn)量增加較為緩慢，之后有較大的提高，72小時(shí)后大麥脂轉(zhuǎn)移蛋白1分泌量的增加速度變慢。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，大麥LTP1的產(chǎn)量一直呈現(xiàn)上升趨勢。到發(fā)酵的132小時(shí)，發(fā)酵液中大麥脂轉(zhuǎn)移蛋白1的分泌量達(dá)到29.45mg/L。
　　 使用含有大麥Ltp1表達(dá)盒和KanMX標(biāo)記序列的

5、轉(zhuǎn)化DNA片段同源重組到釀酒酵母基因組上PEP4基因位點(diǎn)，使一個(gè)PEP4等位基因的編碼序列被外源基因序列所替換。這樣將會使釀酒酵母在表達(dá)啤酒泡沫陽性蛋白—大麥LTP1的同時(shí)，由于PEP4一個(gè)等位基因的缺失而造成其編碼產(chǎn)物—蛋白酶A表達(dá)的降低，從而達(dá)到既增加泡沫陽性蛋白LTP1的含量，又有效降低其被蛋白酶A的降解作用。通過對轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定，得到了基因型為PEP4/pep4：：KanMX—Ltp1的釀酒酵母重組子菌株。對得到的重組菌株進(jìn)

6、行發(fā)酵培養(yǎng)，通過采用變性不連續(xù)SDS—PAGE和Tricine—SDS—PAGE方法對經(jīng)過處理的發(fā)酵液進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中所用到的對釀酒酵母重組菌分泌到培養(yǎng)液的大麥LTP1兩種電泳分析方法中，Tricine—SDS—PAGE方法要比普通的SDS—PAGE方法優(yōu)越。酵母表達(dá)的分子量大小約10KDa的蛋白條帶能夠得到很好的分離。進(jìn)一步免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組菌株分泌的分子量對應(yīng)于10KDa左右的表達(dá)產(chǎn)物為大麥LTP1。
　　 為了確

7、保重組菌株在工業(yè)生產(chǎn)中的安全性，需要對抗性選擇標(biāo)記KanMX進(jìn)行刪除。TEF1啟動子不能被本實(shí)驗(yàn)中所用的釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)所識別，因此使用TEF promoter更換了Sh ble表達(dá)盒中的TEF1 promoter，并構(gòu)建了質(zhì)粒pSH47/ZEO，利用Cre/loxP系統(tǒng)對重組子染色體上的KanMX進(jìn)行了刪除，并成功的使酵母細(xì)胞丟掉了質(zhì)粒pSH47/ZEO。最終獲得了大麥Ltp1表達(dá)盒結(jié)構(gòu)完整、整合位點(diǎn)精確的釀酒酵母重組菌株。
　

8、　 對不同發(fā)酵時(shí)期LXP1的濃度檢測結(jié)果表明，在12°P未加酒花的麥汁中重組菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β在發(fā)酵第108小時(shí)分泌大麥LXP1的濃度分別達(dá)到18.76和18.28mg/L；在8°P添加酒花的麥汁中重組菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β在發(fā)酵第108小時(shí)分泌大麥LTP1的濃度分別達(dá)到12.07和12.13mg/L。對獲得的重組菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β進(jìn)行繼代培養(yǎng)并對其遺傳穩(wěn)定性、生長性