DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性檢測及其抑制劑篩選的電化學生物傳感方法研究.pdf

1、目的：
　　DNA甲基化是表觀遺傳學的一種重要表現(xiàn)形式,它是通過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶催化甲基從供體上轉(zhuǎn)移到目標核酸上這一反應來完成的，甲基化轉(zhuǎn)移酶在這一過程中起到了非常重要的作用，它的量和活性直接影響DNA甲基化的水平。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的異常表達已經(jīng)在多種腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑在抗生素和抗癌治療方面均有應用潛力。本研究的目的在于，利用納米材料的優(yōu)良性能，制備特異靈敏的電化學生物傳感器，用于DNA甲基化和DNA甲

2、基化轉(zhuǎn)移酶活性檢測，并對DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的抑制效果進行分析。
　　方法：
　　1.DNA S3-AuNPs生物復合物的制備：先制備穩(wěn)定的AuNPs，利用DNA S3與AuNPs之間形成的穩(wěn)固的Au-S鍵將兩者結合在一起，并用TEM和UV-vis方法進行表征。
　　2.電化學生物傳感器的制備：依次對預處理后的金電極修飾DNAS1、MCH、BSA、DNA S2、DNAS3-AuNPs，并對每一步修飾結果用電化學方法

3、進行表征。
　　3.優(yōu)化電化學生物傳感器的重要實驗條件：甲基供體SAM的濃度、限制性核酸內(nèi)切酶Mbo I的濃度。
　　4.考察電化學生物傳感器性能：可行性、特異性、線性范圍、最低檢測限、對抑制劑抑制效果的分析、精密度、重復性和穩(wěn)定性等。
　　結果：
　　1.對制備所得的AuNPs和DNA S3-AuNPs進行形態(tài)學和光譜學分析，在TEM中可見AuNPs呈球狀，均勻分散，DNA S3-AuNPs與AuNPs幾乎無區(qū)

4、別；在UV-vis曲線中可見DNA S3-AuNPs的吸收峰比AuNPs的吸收峰紅移了5 nm，表明DNA S3-AuNPs制備成功。
　　2.對電化學生物傳感器的每一步修飾結果用電化學方法進行表征，CV與EIS共同表明電極的每一步修飾都是成功可靠的。
　　3.重要實驗條件的優(yōu)化：SAM最佳濃度為80μM，Mbo I最佳濃度為50 U/mL。
　　4.電化學生物傳感器各項性能：可用于靈敏特異地檢測Dam MTase，并

5、能對其抑制劑5-氟尿嘧啶進行檢測分析；線性范圍是0.075-30 U/mL；最低檢測限是0.02 U/mL；精密度、重復性、穩(wěn)定性均良好。
　　結論：
　　本研究表明，該電化學生物傳感器可以用于對Dam MTase進行特異靈敏的檢測分析，檢測線性范圍是0.075-30 U/mL，最低檢測限是0.02 U/mL；還可以對Dam MTase抑制劑5-氟尿嘧啶進行檢測分析。本方案具有一定的通用性，只要改變相應的DNA序列，形成不同