淀粉基二十二碳六烯酸菌種的構(gòu)建.pdf

1、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，簡(jiǎn)稱DHA)，是人體所必須從體外獲得的一種多不飽和脂肪酸。由于裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）有著DHA含量高、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)快、對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)，所以是一種極具生產(chǎn)前景的DHA微生物資源。國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在用裂殖壺菌用葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)DHA，而淀粉相對(duì)于葡萄糖來(lái)講是一種量大、價(jià)廉的底物，如果能選育出能夠直接以淀粉為碳源生產(chǎn)DHA的優(yōu)良菌株，將會(huì)大大簡(jiǎn)化

2、生產(chǎn)程序，并能夠降低生產(chǎn)成本。本論文采用原生質(zhì)體融合的技術(shù)，將高效利用淀粉的黑曲霉和DHA高產(chǎn)菌株裂殖壺菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，以篩選出能以能夠利用淀粉產(chǎn)DHA的融合菌株。
　　本論文首先確定了裂殖壺菌B4D1和黑曲霉3.316的原生質(zhì)體的制備及其融合條件:所選裂解酶濃度為5 mg/mL，菌齡分別是36h和15h，酶解時(shí)間分別是30min和150 min，原生質(zhì)體形成率和形成量可分別達(dá)92.4％和1.25×106個(gè)，再生率分別達(dá)到58

3、.8％和22.8％。通過(guò)滅活黑曲霉原生質(zhì)體作為遺傳標(biāo)記，利用裂殖壺菌不能利用淀粉的特性，進(jìn)行融合篩選。在30C恒溫條件下，用40％的PEG6000融合10 min，融合率可達(dá)到3.1％。根據(jù)生長(zhǎng)出的融合子的菌落形態(tài)等特征進(jìn)行初篩，以在淀粉作為唯一碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵的菌體油脂產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，得到一株可以利用淀粉并且產(chǎn)DHA的融合子。
　　通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記驗(yàn)證（RAPD技術(shù)）表明B4D1與CGMCC3.316發(fā)生了

4、重組，融合子M-3具有裂殖壺菌和黑曲霉各自特有的基因，且表達(dá)了更多源于B4D1的遺傳信息。對(duì)M-3進(jìn)行傳代遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，在傳代10次后仍能保持遺傳穩(wěn)定性。
　　對(duì)裂殖壺菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Reads過(guò)濾后進(jìn)行拼接，獲得了2158213條Contigs;之后對(duì)Contig進(jìn)行拼接，獲得了31930條Unigenes。將Unigene和COG的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組中的Unigene根據(jù)功能大致可分為25類;根據(jù)GO功能可以分為生物