基于蛋白拆分的Cre-loxp系統(tǒng)構建及其在煙草發(fā)根中刪除活性的初步驗證.pdf

1、植物轉基因技術誕生于20世紀80年代，經歷了三十多年的發(fā)展歷程，在現(xiàn)代農業(yè)生產實踐中應用非常廣泛。它在提高作物產量、改良作物品質、減少殺蟲劑和除草劑等農藥的使用方面有著非常重要的作用，轉基因技術給我們帶來了巨大的經濟效益。與此同時，在全球能源危機日趨嚴重的情況下，轉基因技術在生物能源方面的研究和應用日趨突出?？梢哉f，轉基因產品已經進入到我們的生活中?？墒?，人們對轉基因產品的生物安全方面的擔憂一直沒有消除，針對“轉基因產品是否安全”這一話

2、題的爭論一直在延續(xù)。從某種程度上講，轉基因技術的推廣和應用因為人們的顧慮和爭論而受到了嚴重的制約。因此，如何讓人們既可以享受轉基因產品帶來的福利而又不擔憂轉基因產品可能帶來的危害，這一問題亟待解決。
　　 在轉基因生物安全控制方面的研究中，近年來建立的基因刪除系統(tǒng)“Gene-deletor”備受關注。該系統(tǒng)在一定程度上能夠準確高效的刪除外源基因，但是由于其不能用于有性繁殖的植物和雜交作物，大大限制了該系統(tǒng)的推廣應用。為了克服上述

3、缺點，本研究對組成刪除系統(tǒng)的重要元件一重組酶Cre拆分為N端和C端，構建了一個新的Cre/loxp系統(tǒng)。體外蛋白活性分析和體內實驗證明，重組酶Cre蛋白拆分重建后仍具有較高的重組活性，從而為將來進一步改造“Gene-deletor”奠定了基礎。論文具體研究結果如下:
　　 1、拆分蛋白體外原核表達及活性檢測
　　 構建含有拆分后的重組酶Cre—N端(NCre)、C端(CCre)以及含有完整的重組酶Cre的原核表達載體，誘

4、導表達、純化。蛋白活性檢測結果表明，拆分蛋白的N端（即NCre）無重組活性，而C端(即CCre)仍具有活性，進一步將拆分蛋白的N端和C端混合（即NCre+CCre），也表現(xiàn)出重組活性。
　　 2、植物表達載體構建
　　 以含有內含子(intron)的重組酶Cre的質粒為模板，用高保真DNA聚合酶進行擴增，獲得全長的重組酶Cre以及各拆分片段，構建到中間載體pCXSN上，進一步連接到含有識別位點的載體pCA-LoxP上，篩

5、選獲得了預期的植物表達載體，并將上述載體通過凍融法導入發(fā)根農桿菌C58C1。
　　 3、Cre蛋白體內重組效應分析
　　 采用PCR技術對所有再生發(fā)根進行分子檢測，確定轉化后獲得的陽性轉基因發(fā)根。進一步對PCR檢測呈陽性的發(fā)根進行GUS組織染色，結果發(fā)現(xiàn)，只含有重組酶Cre的單獨的拆分片段（NCre或CCre）的轉基因發(fā)根中，GUS染色為白色，表明單獨的Cre拆分蛋白不具有重組活性;而在同時含有NCre和CCre的轉基因

6、發(fā)根中，GUS染色呈藍色，說明當NCre和CCre同時存在時可以恢復重組活性，其與含有完整的重組酶Cre的刪除結果一致。對刪除后的轉基因發(fā)根進行PCR擴增，測序分析顯示，拆分蛋白NCre和CCre重建后確實恢復了重組活性，可有效刪除轉基因發(fā)根中兩識別位點loxP之間的所有外源基因。
　　 4、GUS陽性率統(tǒng)計
　　 將所有載體轉化煙草，對獲得轉基因發(fā)根進行GUS組織染色，統(tǒng)計每個轉化載體GUS陽性的發(fā)根數(shù)目，重復三次，取