基于蛋白拆分的Cre-loxp系統(tǒng)構(gòu)建及其在煙草發(fā)根中刪除活性的初步驗(yàn)證.pdf

1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)誕生于20世紀(jì)80年代，經(jīng)歷了三十多年的發(fā)展歷程，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用非常廣泛。它在提高作物產(chǎn)量、改良作物品質(zhì)、減少殺蟲(chóng)劑和除草劑等農(nóng)藥的使用方面有著非常重要的作用，轉(zhuǎn)基因技術(shù)給我們帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。與此同時(shí)，在全球能源危機(jī)日趨嚴(yán)重的情況下，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物能源方面的研究和應(yīng)用日趨突出?？梢哉f(shuō)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入到我們的生活中?？墒?，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生物安全方面的擔(dān)憂一直沒(méi)有消除，針對(duì)“轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是否安全”這一話

2、題的爭(zhēng)論一直在延續(xù)。從某種程度上講，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的推廣和應(yīng)用因?yàn)槿藗兊念檻]和爭(zhēng)論而受到了嚴(yán)重的制約。因此，如何讓人們既可以享受轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品帶來(lái)的福利而又不擔(dān)憂轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可能帶來(lái)的危害，這一問(wèn)題亟待解決。
　　 在轉(zhuǎn)基因生物安全控制方面的研究中，近年來(lái)建立的基因刪除系統(tǒng)“Gene-deletor”備受關(guān)注。該系統(tǒng)在一定程度上能夠準(zhǔn)確高效的刪除外源基因，但是由于其不能用于有性繁殖的植物和雜交作物，大大限制了該系統(tǒng)的推廣應(yīng)用。為了克服上述

3、缺點(diǎn)，本研究對(duì)組成刪除系統(tǒng)的重要元件一重組酶Cre拆分為N端和C端，構(gòu)建了一個(gè)新的Cre/loxp系統(tǒng)。體外蛋白活性分析和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，重組酶Cre蛋白拆分重建后仍具有較高的重組活性，從而為將來(lái)進(jìn)一步改造“Gene-deletor”奠定了基礎(chǔ)。論文具體研究結(jié)果如下:
　　 1、拆分蛋白體外原核表達(dá)及活性檢測(cè)
　　 構(gòu)建含有拆分后的重組酶Cre—N端(NCre)、C端(CCre)以及含有完整的重組酶Cre的原核表達(dá)載體，誘

4、導(dǎo)表達(dá)、純化。蛋白活性檢測(cè)結(jié)果表明，拆分蛋白的N端（即NCre）無(wú)重組活性，而C端(即CCre)仍具有活性，進(jìn)一步將拆分蛋白的N端和C端混合（即NCre+CCre），也表現(xiàn)出重組活性。
　　 2、植物表達(dá)載體構(gòu)建
　　 以含有內(nèi)含子(intron)的重組酶Cre的質(zhì)粒為模板，用高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)的重組酶Cre以及各拆分片段，構(gòu)建到中間載體pCXSN上，進(jìn)一步連接到含有識(shí)別位點(diǎn)的載體pCA-LoxP上，篩

5、選獲得了預(yù)期的植物表達(dá)載體，并將上述載體通過(guò)凍融法導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1。
　　 3、Cre蛋白體內(nèi)重組效應(yīng)分析
　　 采用PCR技術(shù)對(duì)所有再生發(fā)根進(jìn)行分子檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)化后獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因發(fā)根。進(jìn)一步對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的發(fā)根進(jìn)行GUS組織染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只含有重組酶Cre的單獨(dú)的拆分片段（NCre或CCre）的轉(zhuǎn)基因發(fā)根中，GUS染色為白色，表明單獨(dú)的Cre拆分蛋白不具有重組活性;而在同時(shí)含有NCre和CCre的轉(zhuǎn)基因

6、發(fā)根中，GUS染色呈藍(lán)色，說(shuō)明當(dāng)NCre和CCre同時(shí)存在時(shí)可以恢復(fù)重組活性，其與含有完整的重組酶Cre的刪除結(jié)果一致。對(duì)刪除后的轉(zhuǎn)基因發(fā)根進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序分析顯示，拆分蛋白NCre和CCre重建后確實(shí)恢復(fù)了重組活性，可有效刪除轉(zhuǎn)基因發(fā)根中兩識(shí)別位點(diǎn)loxP之間的所有外源基因。
　　 4、GUS陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)
　　 將所有載體轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)獲得轉(zhuǎn)基因發(fā)根進(jìn)行GUS組織染色，統(tǒng)計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)化載體GUS陽(yáng)性的發(fā)根數(shù)目，重復(fù)三次，取