高效抗蟲多基因轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建及其在煙草中表達(dá)驗(yàn)證.pdf

1、利用多基因共表達(dá)策略將多種不同性狀目的基因轉(zhuǎn)入植物，以提高植物的綜合抗逆能力是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用重要領(lǐng)域之一。本研究構(gòu)建通過(guò)攜帶NotⅠ/Bsp120Ⅰ同尾酶的植物轉(zhuǎn)化載體和攜帶SpeⅠ/XbaⅠ/NheⅠ同尾酶克隆載體，利用同尾酶連接后原有酶切位點(diǎn)消失原理，可不斷在植物轉(zhuǎn)化載體中連入新的已知功能的Bt抗蟲基因cry1Ac、cry3A和選擇標(biāo)記gus基因。同時(shí)通過(guò)在植物轉(zhuǎn)化載體中增加MAR結(jié)構(gòu)，載體中更換不同啟動(dòng)子、在啟動(dòng)子后加入增強(qiáng)子

2、序列及調(diào)換連入外源基因ORF的順序等方法，對(duì)多基因植物轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，構(gòu)建出系列植物轉(zhuǎn)化載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，以期實(shí)現(xiàn)多外源基因穩(wěn)定與高效表達(dá)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以pCAMBIA1302為基礎(chǔ)表達(dá)載體構(gòu)建了植物表達(dá)載體p1780，該載體含有來(lái)源于pCAMBIA1302的nptⅡ抗性選擇標(biāo)記（另引入獨(dú)立的NOS終止子），克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別添加了保證外源基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄表達(dá)的煙草MAR序列及同尾酶系統(tǒng)

3、的酶切位點(diǎn)Bsp120Ⅰ和SpeⅠ;以pBI121為基礎(chǔ)克隆載體構(gòu)建了克隆載體p699(35S)，該載體含有35S啟動(dòng)子和位于35S啟動(dòng)子下游的擬南芥AtADH5'-UTR翻譯增強(qiáng)子序列;通過(guò)對(duì)p699替換啟動(dòng)子，改造成分別含有Coymv和FMV啟動(dòng)子的克隆載體p820(coy)和p820(FMV);三個(gè)克隆載體克隆位點(diǎn)均為NotⅠ和XbaⅠ/NheⅠ同尾酶酶切位點(diǎn);所構(gòu)建的植物表達(dá)載體p1780和克隆載體p699/p820，可利用同尾

4、酶技術(shù)選用合適的雙酶切(NotⅠ/Bsp120Ⅰ和SpeⅠ/XbaⅠ/NheⅠ)構(gòu)建含有一個(gè)和（或）多個(gè)外源基因的植物表達(dá)載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)可方便對(duì)同一表達(dá)載體引入不同外源目的基因及實(shí)現(xiàn)不同基因的排列組合。
　　2.利用上述載體系統(tǒng)，成功構(gòu)建了8個(gè)具有已知功能目的cry1Ac基因和cry3A基因及gus報(bào)告基因不同組合的植物轉(zhuǎn)化載體:p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac、p1780-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、

5、p1780-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、p1780-Coy∷cry3A-FMV∷gus-35S∷cry1Ac、p1780-FMV∷gus-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A。
　　3.將不同植物轉(zhuǎn)化載體搖菌形成侵染菌液，

6、設(shè)置Kan抗生素和Cef抗生素各11個(gè)濃度梯度，確定轉(zhuǎn)基因過(guò)程中分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的Kan最適濃度分別為50mg/L和75mg/L，Cef最適濃度分別為300mg/L和600mg/L，在此濃度條件下可很好抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)且形成良好煙草分化植株;將不同轉(zhuǎn)化載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)分化、生根成苗、再分化、溫室及蔭棚訓(xùn)化、大田移栽等步驟，每個(gè)不同轉(zhuǎn)化載體獲得13～30株系不等，最終共獲得155個(gè)株系612棵陽(yáng)性煙草成苗。
　　

7、4.經(jīng)gus組織化學(xué)染色初步篩選，6個(gè)含有g(shù)us基因的轉(zhuǎn)化載體所獲煙草轉(zhuǎn)基因植株均獲得陽(yáng)性染色結(jié)果;進(jìn)一步用nptⅡ抗性標(biāo)記基因、gus基因、cry1Ac和cry3A目的抗蟲基因各自的特異性引物進(jìn)行轉(zhuǎn)化煙草植株的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，所有具相應(yīng)外源基因的轉(zhuǎn)基因煙草株系均可獲得陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，證明轉(zhuǎn)化載體所含外源基因已與煙草基因組整合。
　　5.采用QRT-PCR對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性煙草中隨機(jī)選取的10個(gè)株系進(jìn)行g(shù)us、cry1Ac和c

8、ry3A基因轉(zhuǎn)錄檢測(cè)，不同株系相應(yīng)目的基因轉(zhuǎn)錄豐度介于103～107之間，表明轉(zhuǎn)化載體所攜帶外源基因可在煙草體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄，同一轉(zhuǎn)化載體獲得不同株系、不同外源基因排列組合的目的基因間轉(zhuǎn)錄豐度無(wú)顯著性差異。
　　6.采用ELISA試劑盒對(duì)相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系Cry1Ac和Cry3A蛋白進(jìn)行檢測(cè)，Cry1Ac蛋白表達(dá)量介于0.45～11.61μg/g之間，Cry3A蛋白表達(dá)量介于0.78～6.73μg/g之間，表明外源Bt基因可在轉(zhuǎn)基因煙草

9、植株體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)蛋白。不同轉(zhuǎn)化載體之間蛋白表達(dá)存在差異，同一轉(zhuǎn)化載體不同株系之間也存在差異。
　　7.對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行室內(nèi)飼蟲試驗(yàn)，表明外源Bt毒蛋白具有較高殺蟲活性，其中含有cry1Ac基因的4個(gè)轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的所有株系、含有cry3A基因的2個(gè)轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的所有株系分別對(duì)棉鈴蟲和茄二十八星瓢蟲一齡幼蟲在飼喂第1d致死率達(dá)到100％，其余含不同Bt基因的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)棉鈴蟲和茄二十八星瓢蟲幼蟲致死效果表現(xiàn)慢效性，一般在第6d或第

10、7d達(dá)到100％;不同轉(zhuǎn)化載體所攜帶Bt基因毒蛋白表達(dá)與相應(yīng)蟲試結(jié)果高度相關(guān)。
　　8.所構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體具有較好應(yīng)用前景，用于其他植物材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化防治棉鈴蟲時(shí)推薦優(yōu)先使用p1780-FMV∷gus-35S∷cry1A、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A;用于防治茄二十八星瓢