水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記致病相關(guān)因子的鑒定.pdf

1、水稻白葉枯病和水稻細(xì)菌性條斑病（簡(jiǎn)稱水稻條斑?。┦撬旧献钪匾膬蓚€(gè)細(xì)菌性病害，在我國(guó)乃至東南亞的某些地區(qū)甚至成為主要病害，危害巨大。其病原菌分別是Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)和X.oryzae pv.oryzicola(Xoc)，同屬于稻黃單胞桿菌，具有非常近的親緣關(guān)系，在形態(tài)特征以及生理生化性質(zhì)上十分相似。在病害防治中如初始菌量的調(diào)查、病菌數(shù)量的統(tǒng)計(jì)以及日常的種子檢驗(yàn)檢疫中經(jīng)常造成困難，因此需要

2、方便、快捷及準(zhǔn)確的鑒定方法。
　　本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建了比較基因組學(xué)算法，并且基于現(xiàn)有的全基因組序列對(duì)Xoo和Xoc進(jìn)行分析，獲得了一系列的用于區(qū)分水稻白葉枯病菌與條斑病菌病菌的電子分子標(biāo)記917對(duì)，對(duì)其中三種類型的多態(tài)性標(biāo)記(Xoo特異性、Xoc特異性、Xoo和Xoc共顯性等)隨機(jī)選取了130對(duì)在40個(gè)已得到鑒定的菌株中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析，分別獲得30對(duì)Xoo特異性的分子標(biāo)記，24對(duì)Xoc特異性分子標(biāo)記，14對(duì)Xoo和Xoc

3、共顯性的分子標(biāo)記。這些特異性分子標(biāo)記可直接應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫工作，并可發(fā)展多標(biāo)記協(xié)同檢測(cè)方法，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性。
　　同時(shí)，本研究對(duì)水稻條斑病菌中特異的Ⅲ型分泌效應(yīng)蛋白AvrRxo1進(jìn)行了研究，開(kāi)發(fā)出相關(guān)特異的分子標(biāo)記。AvrRxo1是一類non-TAL類效應(yīng)因子，其生物學(xué)功能未知。本研究利用煙草瞬時(shí)表達(dá)體系發(fā)現(xiàn)，表達(dá)AvrRxo1對(duì)非寄主煙草細(xì)胞具有毒性功能，同時(shí)來(lái)源于不同Xoc菌株的avrRxo1等位基因的毒性功能存在差異。通過(guò)分

4、析五個(gè)菌株來(lái)源的AvrRxo1的氨基酸序列并結(jié)合定點(diǎn)突變驗(yàn)證，明確了AvrRxo1蛋白的第344位絲氨酸對(duì)其毒性功能具有重要作用。進(jìn)一步對(duì)AvrRxo1蛋白分別從氨基端和羧基端進(jìn)行截短實(shí)驗(yàn)以及預(yù)測(cè)的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)進(jìn)行突變實(shí)驗(yàn)，明確了AvrRxo1蛋白羧基端的完整性對(duì)其毒性功能的發(fā)揮是必需的。
　　此外，前期研究暗示水稻白葉枯病菌可能代謝產(chǎn)生IAA并將其作為侵染水稻的致病因子。本研究利用同源重組的方法在PXO99A中獲得了四個(gè)預(yù)

5、測(cè)與IAA合成相關(guān)基因的突變菌株:P△pxo_04004、P△pxo_04823、P△pxo_00867和P△pxo_03584。利用高效液相色譜儀對(duì)野生型菌株P(guān)XO99A及其四個(gè)突變菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，PXO99A可以代謝生成IAA，產(chǎn)量約為2.6μg/ml，而其突變體代謝IAA產(chǎn)量顯著降低，證明了水稻黃單胞菌中存在多種IAA合成途徑。與預(yù)期相反，致病力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變菌株相比于野生型PXO99A致病力顯著提高。對(duì)

6、突變菌株的生理生化進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四個(gè)突變菌株的重要的致病因子之一胞外多糖(EPS)的產(chǎn)量得到提高。雙向電泳技術(shù)的初步分析也顯示了突變菌株在分泌蛋白分泌量和種類上與野生型相比也存在差異，有望揭示IAA負(fù)調(diào)控黃單胞桿菌致病因子合成的機(jī)制。
　　綜上所述，本研究開(kāi)發(fā)了大量鑒別Xoo和Xoc的PCR標(biāo)記，并對(duì)其中一個(gè)分子標(biāo)記的靶標(biāo)基因avrRxo1的致病性功能進(jìn)行了分析。同時(shí)鑒定了Xoo中存在IAA的合成途徑，并證明其參與負(fù)調(diào)控黃單胞桿菌