水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記致病相關(guān)因子的鑒定.pdf

1、水稻白葉枯病和水稻細(xì)菌性條斑?。ê?jiǎn)稱(chēng)水稻條斑病）是水稻上最重要的兩個(gè)細(xì)菌性病害，在我國(guó)乃至東南亞的某些地區(qū)甚至成為主要病害，危害巨大。其病原菌分別是Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)和X.oryzae pv.oryzicola(Xoc)，同屬于稻黃單胞桿菌，具有非常近的親緣關(guān)系，在形態(tài)特征以及生理生化性質(zhì)上十分相似。在病害防治中如初始菌量的調(diào)查、病菌數(shù)量的統(tǒng)計(jì)以及日常的種子檢驗(yàn)檢疫中經(jīng)常造成困難，因此需要

2、方便、快捷及準(zhǔn)確的鑒定方法。
　　本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建了比較基因組學(xué)算法，并且基于現(xiàn)有的全基因組序列對(duì)Xoo和Xoc進(jìn)行分析，獲得了一系列的用于區(qū)分水稻白葉枯病菌與條斑病菌病菌的電子分子標(biāo)記917對(duì)，對(duì)其中三種類(lèi)型的多態(tài)性標(biāo)記(Xoo特異性、Xoc特異性、Xoo和Xoc共顯性等)隨機(jī)選取了130對(duì)在40個(gè)已得到鑒定的菌株中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析，分別獲得30對(duì)Xoo特異性的分子標(biāo)記，24對(duì)Xoc特異性分子標(biāo)記，14對(duì)Xoo和Xoc

3、共顯性的分子標(biāo)記。這些特異性分子標(biāo)記可直接應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫工作，并可發(fā)展多標(biāo)記協(xié)同檢測(cè)方法，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性。
　　同時(shí)，本研究對(duì)水稻條斑病菌中特異的Ⅲ型分泌效應(yīng)蛋白AvrRxo1進(jìn)行了研究，開(kāi)發(fā)出相關(guān)特異的分子標(biāo)記。AvrRxo1是一類(lèi)non-TAL類(lèi)效應(yīng)因子，其生物學(xué)功能未知。本研究利用煙草瞬時(shí)表達(dá)體系發(fā)現(xiàn)，表達(dá)AvrRxo1對(duì)非寄主煙草細(xì)胞具有毒性功能，同時(shí)來(lái)源于不同Xoc菌株的avrRxo1等位基因的毒性功能存在差異。通過(guò)分

4、析五個(gè)菌株來(lái)源的AvrRxo1的氨基酸序列并結(jié)合定點(diǎn)突變驗(yàn)證，明確了AvrRxo1蛋白的第344位絲氨酸對(duì)其毒性功能具有重要作用。進(jìn)一步對(duì)AvrRxo1蛋白分別從氨基端和羧基端進(jìn)行截短實(shí)驗(yàn)以及預(yù)測(cè)的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)進(jìn)行突變實(shí)驗(yàn)，明確了AvrRxo1蛋白羧基端的完整性對(duì)其毒性功能的發(fā)揮是必需的。
　　此外，前期研究暗示水稻白葉枯病菌可能代謝產(chǎn)生IAA并將其作為侵染水稻的致病因子。本研究利用同源重組的方法在PXO99A中獲得了四個(gè)預(yù)

5、測(cè)與IAA合成相關(guān)基因的突變菌株:P△pxo_04004、P△pxo_04823、P△pxo_00867和P△pxo_03584。利用高效液相色譜儀對(duì)野生型菌株P(guān)XO99A及其四個(gè)突變菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，PXO99A可以代謝生成IAA，產(chǎn)量約為2.6μg/ml，而其突變體代謝IAA產(chǎn)量顯著降低，證明了水稻黃單胞菌中存在多種IAA合成途徑。與預(yù)期相反，致病力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變菌株相比于野生型PXO99A致病力顯著提高。對(duì)

6、突變菌株的生理生化進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四個(gè)突變菌株的重要的致病因子之一胞外多糖(EPS)的產(chǎn)量得到提高。雙向電泳技術(shù)的初步分析也顯示了突變菌株在分泌蛋白分泌量和種類(lèi)上與野生型相比也存在差異，有望揭示IAA負(fù)調(diào)控黃單胞桿菌致病因子合成的機(jī)制。
　　綜上所述，本研究開(kāi)發(fā)了大量鑒別Xoo和Xoc的PCR標(biāo)記，并對(duì)其中一個(gè)分子標(biāo)記的靶標(biāo)基因avrRxo1的致病性功能進(jìn)行了分析。同時(shí)鑒定了Xoo中存在IAA的合成途徑，并證明其參與負(fù)調(diào)控黃單胞桿菌