基于寡核苷酸信號(hào)放大的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留熒光免疫分析方法研究.pdf

1、農(nóng)藥殘留受到各國(guó)政府與消費(fèi)者關(guān)注，其檢測(cè)技術(shù)已受到越來(lái)越多的重視。因此，建立有效的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，特別是靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境、消費(fèi)者健康具有重要意義。
　　本研究以間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析為基礎(chǔ)，結(jié)合膠體金和寡核苷酸鏈信號(hào)放大技術(shù)，熒光標(biāo)記寡核苷酸鏈探針提供檢測(cè)信號(hào)，先后建立了針對(duì)三唑磷農(nóng)藥單殘留和三唑磷、對(duì)硫磷、毒死蜱農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的寡核苷酸信號(hào)放大免疫分析方法。主要內(nèi)容如下:
　　采用檸檬酸鈉還原法

2、，合成了粒徑均一、形狀規(guī)則、分散性良好、濃度約為99nM的膠體金。將農(nóng)藥單克隆抗體和熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈標(biāo)記在膠體金表面，對(duì)標(biāo)記過(guò)程的穩(wěn)定劑濃度、老化時(shí)間、抗體濃度、寡核苷酸序列等條件進(jìn)行優(yōu)化，得到寡核苷酸熒光探針。
　　利用間接競(jìng)爭(zhēng)模式，建立了基于寡核苷酸信號(hào)放大的三唑磷農(nóng)藥熒光免疫分析方法，并對(duì)方法的分析條件如探針與半抗原的工作濃度、二硫蘇糖醇(DTT)工作條件、甲醇濃度等進(jìn)行了優(yōu)化。方法在001-20μg L-1范圍內(nèi)線性關(guān)

3、系良好，檢出限為6ng L-1。利用本方法進(jìn)行了水、大米、黃瓜、甘藍(lán)和蘋果基質(zhì)添加回收試驗(yàn)。方法的平均回收率為850％-1103％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為94％-174％。進(jìn)一步將該方法與三唑磷的ELISA、LC-MS/MS分析方法進(jìn)行了比較和確證。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高，滿足農(nóng)產(chǎn)品中三唑磷農(nóng)藥殘留分析要求，可用于實(shí)際樣品檢測(cè)。
　　在三唑磷農(nóng)藥分析方法基礎(chǔ)上，建立了基于寡核苷酸信號(hào)放大的三唑磷、對(duì)硫磷和毒死蜱農(nóng)藥多殘留熒光免

4、疫分析方法。在7種熒光標(biāo)記物中篩選出3種熒光強(qiáng)度高、激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)交叉少的熒光物質(zhì)作為寡核苷酸鏈標(biāo)記物，即6-FAM、Cy3和Texas red，并研究了3種探針與3種包被半抗原之間的交叉反應(yīng)，進(jìn)一步優(yōu)化了對(duì)硫磷、毒死蜱探針和半抗原的工作濃度。結(jié)果表明，3種探針與3種包破半抗原之間特異性良好，三唑磷、對(duì)硫磷和毒死蜱分別在001-20μg L-1、005-50μg L-1、05-1000μg L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限分別為0007