有機(jī)磷農(nóng)藥單殘留及多殘留免疫分析方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、利用活潑酯法將半抗原O-甲基-O-（4-硝基苯基）-N-（丁酸）硫代磷酸酯(Hapten1)與載體蛋白BSA和OVA結(jié)合。Hapten1-OVA用作篩選抗體的包被抗原，而Hapten1-BSA作為免疫原，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫。通過PEG將小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合制備雜交瘤細(xì)胞。通過對(duì)雜交瘤細(xì)胞的篩選和亞克隆，獲得了一株能夠穩(wěn)定分泌抗有機(jī)磷類農(nóng)藥單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(C8/D3)。其分泌的抗體為IgG1型，

2、輕鏈為k鏈，親和常數(shù)達(dá)到2.3×107 L/mol，是可以用于建立檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥多殘留免疫分析的研究材料。
　　 利用制備的寬特異性抗體C8/D3建立了能夠用于檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥的多殘留酶聯(lián)免疫分析。為了使建立的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)具有更好的敏感性，根據(jù)IC50值，從12種抗體/包被抗原的組合中篩選出敏感性最好的抗體/包被抗原組合。本論文所建ELISA對(duì)8種有機(jī)磷農(nóng)藥的IC50值為3.5到162.2 ng/mL。通

3、過對(duì)23種有機(jī)磷農(nóng)藥交叉反應(yīng)性的研究來確定所建ELSIA的選擇性，研究結(jié)果表明所建ELISA可分析的對(duì)象為甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、殺螟硫磷、殺螟腈、EPN、Paraoxon-methyl、Paraoxon、Fenitrooxon8種有機(jī)磷農(nóng)藥。在對(duì)卷心菜、蘋果、青菜樣品的添加回收試驗(yàn)中，甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、殺螟硫磷單個(gè)農(nóng)藥的添加回收率在78.9％和118.1％之間。此外，將ELISA的檢測(cè)結(jié)果與GC的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較驗(yàn)證，兩種分析方法的檢

4、測(cè)結(jié)果接近。這些研究結(jié)果表明，本論文所建立的ELISA是一種可以用于檢測(cè)不同樣品中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的分析方法。
　　 利用膠體金標(biāo)記甲基毒死蜱單克隆抗體3G7/F5，成功建立了可以快速（小于10分鐘）、定性及定量檢測(cè)水樣中甲基毒死蜱的免疫層析分析(ICA)方法。對(duì)工作溶液的pH值和鹽離子強(qiáng)度進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選，獲得工作溶液的最佳pH值為9.0，最佳鹽離子強(qiáng)度為0.4 M。通過目測(cè)確定該免疫層析分析的定性檢測(cè)檢測(cè)限為0.6μg/mL

5、。在定量檢測(cè)中，利用試紙條讀條儀讀取檢測(cè)結(jié)果的光密度值，并建立標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線和校正曲線，得到回歸方程為y=-2.5229x+7.5951，相關(guān)系數(shù)的平方(R2)為0.9889。通過計(jì)算得到IC50和檢測(cè)限(IC10)分別為1024.4 ng/mL和137.9 ng/mL。與甲基毒死蜱結(jié)構(gòu)相似農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均小于1％，可以認(rèn)為與其他分析物沒有交叉反應(yīng)。在自來水樣的添加回收試驗(yàn)中，甲基毒死蜱的添加回收率在102.5％到107.6％之間。因此

6、，本研究所制備的ICA檢測(cè)試紙條可以作為甲基毒死蜱的快速的、定性或定量的檢測(cè)工具。
　　 在金標(biāo)單克隆抗體C8/D3和最優(yōu)半抗原(H9-OVA)的基礎(chǔ)上，制備了有機(jī)磷類農(nóng)藥多殘留免疫層析試紙條，并建立了一種可以快速（5分鐘）、簡(jiǎn)便地檢測(cè)不同樣品中有機(jī)磷類農(nóng)藥多殘留免疫層析分析(ICA)方法。利用試紙條讀條儀讀取檢測(cè)結(jié)果的光密度值，計(jì)算出在最優(yōu)條件下，所建立的ICA對(duì)8種有機(jī)磷農(nóng)藥的IC50值從11.8到470.4 ng/mL。通

7、過對(duì)23種有機(jī)磷農(nóng)藥交叉反應(yīng)性的研究來確定所建ICA的選擇性，研究結(jié)果表明所建ICA的分析對(duì)象為甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、殺螟硫磷、殺螟腈、EPN、Paraoxon-methyl、Paraoxon、 Fenitrooxon8種有機(jī)磷農(nóng)藥。在對(duì)卷心菜、蘋果、青菜樣品的添加回收試驗(yàn)中，甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、殺螟硫磷單個(gè)農(nóng)藥的添加回收率都在70.6％和131.9％之間。與ELISA比較可以發(fā)現(xiàn)ICA的檢測(cè)結(jié)果和ELISA很接近，但是ICA在檢測(cè)時(shí)間、

8、檢測(cè)程序、基質(zhì)影響、就地檢測(cè)等方面要優(yōu)于ELSIA。因此，我們可以認(rèn)為，本研究所建立的ICA對(duì)于定性、半定量、定量檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥來說是一種非常實(shí)用的檢測(cè)方法。
　　 利用生物淘選的方法，從環(huán)形8肽噬菌體肽庫中篩選出4種能夠用作抗原的噬菌體肽，并建立了檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥的噬菌體模擬表位多殘留酶聯(lián)免疫分析。為了使建立的噬菌體模擬表位酶聯(lián)免疫分析(P-ELISA)具有更好的敏感性，根據(jù)Amax/IC50值，從4種噬菌體抗原/抗體

9、的組合中篩選出敏感性最好的噬菌體抗原/抗體組合。本論文建立的P-ELISA對(duì)8種有機(jī)磷農(nóng)藥的IC50值從1.4到92.1 ng/mL，其敏感性比人工包被抗原ELISA提高了1倍。通過對(duì)23種有機(jī)磷農(nóng)藥交叉反應(yīng)性的研究來確定所建P-ELISA的選擇性，研究結(jié)果表明所建P-ELISA的分析對(duì)象為甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、殺螟硫磷、殺螟腈、EPN、Paraoxon-methyl、Paraoxon、Fenitrooxon8種有機(jī)磷農(nóng)藥。在對(duì)卷心菜、蘋