有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留免疫分析方法的研究.pdf

1、本論文旨在研究有機(jī)磷農(nóng)藥的多殘留酶聯(lián)免疫(ELISA)分析方法。試驗(yàn)首先以對(duì)羥基苯丙酸和二甲氧基磷酰氯為原料，通過(guò)甲酯化、?；?、水解三個(gè)步驟合成了甲基對(duì)氧磷的半抗原O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯。將甲基對(duì)氧磷半抗原和對(duì)硫磷半抗原(氨基對(duì)硫磷)分別與不同的載體蛋白(BSA，OVA)偶聯(lián)，制備了對(duì)應(yīng)的免疫原和包被原。每種免疫原分別免疫兩只新西蘭大白兔獲得多克隆抗體。通過(guò)方陣滴定法確定工作濃度及血清效價(jià)，并選擇較優(yōu)的血清供后面試

2、驗(yàn)用。
　　 以對(duì)硫磷為例建立了間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析方法，并對(duì)ELISA分析的影響因素如有機(jī)溶劑的種類及含量、離子強(qiáng)度、pH進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下，建立了對(duì)硫磷和甲基對(duì)氧磷的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線和回歸方程。其中對(duì)硫磷的IC50為0.343μg/mL，LOD(IC10)為0.005μg/mL，線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.014～8.24μg/mL；甲基對(duì)氧磷的IC50為0.368μg/mL，LOD(IC10)為0.004μg

3、/mL，線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.015～12.02μg/mL。以包菜為樣本，同時(shí)添加了對(duì)硫磷和甲基對(duì)氧磷，在不同的孔中同時(shí)測(cè)得兩種農(nóng)藥的回收率分別為79.00%～88.40%和74.00%～81.40%，變異系數(shù)分別為3.48%～8.53%和3.53%～7.89%。該分析方法重復(fù)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%，可以滿足對(duì)硫磷和甲基對(duì)氧磷同時(shí)檢測(cè)的要求。
　　 另外，還針對(duì)常用的二乙氧基有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行了多殘留酶聯(lián)免疫分

4、析方法的研究。首先對(duì)幾種常用的二乙氧基磷酸酯農(nóng)藥毒死蜱、二嗪農(nóng)、對(duì)硫磷、對(duì)氧磷、辛硫磷等的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們的共性結(jié)構(gòu)為(C2H5O)2P(O)或(C2H5O)2P(S)，于是選擇乙氧基膦酸乙酸((C2H5O)2P(O)CH2COOH)作為通用半抗原(DPA)。通過(guò)活性酯法將半抗原(DPA)與不同的載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)，制備了人工抗原。以其BSA偶聯(lián)物作為免疫原免疫新西蘭大白兔，獲得兩種多克隆抗體。以半抗原(DPA)和對(duì)氧

5、磷作為小分子競(jìng)爭(zhēng)物，對(duì)抗體及其免疫分析條件進(jìn)行了篩選和試驗(yàn)，在優(yōu)化條件下建立了針對(duì)對(duì)氧磷的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線和回歸方程。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了其它結(jié)構(gòu)類似化合物的抑制試驗(yàn)，測(cè)定了它們的交叉反應(yīng)。結(jié)果表明，由DPA抗原產(chǎn)生的抗體對(duì)對(duì)氧磷和嘧啶磷表現(xiàn)一定的識(shí)別，兩者的IC50分別為1.69μg/mL和2.33μg/mL，交叉反應(yīng)率分別為13.3%和9.6%；對(duì)其他有機(jī)磷藥物(對(duì)硫磷、毒死蜱、二嗪農(nóng)、馬拉硫磷)等沒(méi)有識(shí)別作用。以包菜為樣本，分別添加了對(duì)氧