半胱氨酸白三烯影響OSAHS患兒腺樣體T細(xì)胞增殖及凋亡的作用與機(jī)制.pdf

1、第一部分孟魯司特鈉與鼻用糖皮質(zhì)激素治療兒童OSAHS的臨床療效觀察
　　目的:分析診斷為兒童阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrom，OSAHS)并住院行手術(shù)治療的患兒臨床特征，對比觀察半胱氨酰白三烯受體1(CysLTR1)阻斷劑孟魯司特鈉和鼻用糖皮質(zhì)激素治療兒童OSAHS的臨床療效，探討臨床非手術(shù)治療兒童輕度OSAHS的可行性。
　　方法:(1)回顧性

2、分析2011年1月至2013年9月在我院耳鼻咽喉科就診并住院手術(shù)的2257例OSAHS病人資料，分析病人的性別、年齡、既往疾病史、扁桃體腺樣體特征、PSG監(jiān)測數(shù)據(jù)AHI和最低SpO2等臨床特征;(2)按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)選取2012年10月至2013年10月在我院耳鼻咽喉科專科門診就診并診斷為OSAHS輕度的患兒189例，隨機(jī)分配入三個治療組:A組（口服孟魯司特鈉治療）63例，B組（鼻噴糠酸莫米松治療）63例，C組（口服孟魯司特鈉+鼻噴糠

3、酸莫米松治療）63例;(3)治療方案如下:A組:口服孟魯司特鈉(＜6歲者4 mg，≥6歲者5mg)1次/晚，連續(xù)12周;B組:鼻噴糠酸莫米松鼻噴霧劑1次/晨起，左右鼻腔各一噴(50μg)，連續(xù)12周;C組:口服孟魯司特鈉（用法同A組），鼻噴糠酸莫米松鼻噴霧劑（用法同A組），連續(xù)12周;(4)采用電話問卷式調(diào)查隨訪臨床癥狀，并評分;治療前和治療12周后行PSG監(jiān)測;(5)對比分析三組病人治療前后臨床癥狀改善情況及有效率;(6)將治療A組分

4、為A1組（治療有效組）和A2組（治療無效組），對比分析兩組臨床特征的差異性。
　　結(jié)果:(1)住院OSAHS患兒中，學(xué)齡前3-6歲是發(fā)病高峰(56％)，男多于女(1.6∶1)，病情以中度為主((52.5％)，輕度的患兒占有一定比例(32.3％)，部分病人伴有變應(yīng)性鼻炎(11.7％);(2)治療后，三組患兒打鼾、張口呼吸、睡眠不安、及呼吸暫停等臨床癥狀及PSG監(jiān)測結(jié)果均較治療前明顯改善;（3)C組患兒與A組和B組相比，打鼾、呼吸暫停

5、及睡眠不安等臨床癥狀消失時間均縮短，C組患兒治療后總有效率較A組和B組均高，A組和B組兩組間各項值無顯著差異;(4)A2組的扁桃體大小分級明顯高于A1組。
　　結(jié)論:(1)輕度OSAHS在住院OSAHS患兒中占有約1/3比例;(2)對輕度OSAHS患兒，圍手術(shù)期可采用口服孟魯司特鈉或鼻噴糖皮質(zhì)激素或二者聯(lián)用治療，能有效縮小腺樣體體積，緩解部分臨床癥狀，聯(lián)合用藥總有效率較單用藥更高，緩解癥狀更快。以上臨床觀察結(jié)果均提示炎癥反應(yīng)可能參

6、與了上氣道淋巴組織增生肥大的病理機(jī)制;(3)孟魯司特鈉可能對伴有3度以上扁桃體肥大的OSAHS治療效果不佳。
　　第二部分 LTD4對腺樣體T細(xì)胞增殖及凋亡的作用研究
　　目的:觀察CysLTR1在OSAHS患兒腺樣體組織中的表達(dá)與細(xì)胞定位，研究LTD4對腺樣體單個核細(xì)胞(AdMC)中CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　方法:(1)收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科因OSAHS或分泌性中耳炎（對照組）

7、住院行腺樣體切除術(shù)患兒的腺樣體組織;(2)收集的標(biāo)本分為三個組:AHI＜5組、5＜AHI＜10組、AHI＞10組，分離AdMC，用ConA刺激培養(yǎng)48小時，收集上清，ELISA檢測LTC4的表達(dá)水平;(3)收集的標(biāo)本制備石蠟切片，免疫組化法檢測CysLTR1在腺樣體組織中的表達(dá)情況，免疫熒光雙標(biāo)法激光共聚焦觀察CysLTR1是否可表達(dá)于CD3+T細(xì)胞;(4)分離AdMC，分為4個組:對照組，PHA刺激組，PHA+LTD4組和PHA+LT

8、D4+孟魯斯特納(montelukast)組，CFSE標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測LTD4對PHA刺激的AdMC中CD4+、CD8+T細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用;(5)分離AdMC，分為4個組:對照組，DEX刺激組，DEX+LTD4組，DEX+LTD4組+montelukast組，AnnexinⅤ FITC/PI雙染FCM檢測LTD4對DEX誘導(dǎo)的AdMC中CD4+、CD8+T細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:(1) OSAHS患兒組腺樣

9、體CysLTR1的表達(dá)水平顯著高于對照組，CysLTR1在OSAHS患兒腺樣體組織中部分表達(dá)于CD3+T細(xì)胞，但并非優(yōu)勢表達(dá);(2)中重度組分泌的LTC4水平顯著高于正常對照組與輕度組;(3) LTD4+PHA共同刺激AdMC后，CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖率比PHA組明顯增加，montelukast可抑制LTD4的促增殖效應(yīng);(4) LTD4+DEX共同刺激AdMC后，CD4+T和CD8+T細(xì)胞的早期凋亡率比DEX組明顯降低，mo

10、ntelukast可抑制LTD4的抑制凋亡效應(yīng)。
　　結(jié)論:(1) AdMC上清液中LTC4的表達(dá)與OSAHS患兒病情程度相關(guān);(2) CysLTR1在腺樣體組織中表達(dá)增高，部分CysLTR1定位于CD3+T細(xì)胞，提示CysLTs可能與腺樣體組織增生肥大相關(guān)，并可能參與兒童OSAHS的發(fā)病機(jī)理;(3)LTD4對AdMC來源的CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖和凋亡具有調(diào)節(jié)功能。
　　第三部分 LTD4調(diào)節(jié)腺樣體T細(xì)胞增殖及凋亡

11、的機(jī)制研究
　　目的:探討LTD4是否通過MAPKs通路調(diào)節(jié)AdMC中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞細(xì)胞增殖和凋亡。
　　方法:(1)分離AdMC，分為對照組和處理組，處理組中加入PHA（濃度10ug/ml）和LTD4(濃度1×10-4 mmol/l)，24孔板中，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)。按培養(yǎng)時間點(diǎn)5min、15min、30min、1h、2h、12h收集細(xì)胞，提取總蛋白;(2)Western blot法檢測LTD4對M

12、APK通路P38、ERK1/2、JNK的磷酸化蛋白及非磷酸化總蛋白的影響;(3)分離AdMC，分為四個組:對照組、PHA組、PHA+LTD4組和PHA+LTD4+p38抑制劑SB203580組或PHA+LTD4+ERK1/2抑制PD98059組，CFSE標(biāo)記法FCM檢測，觀察CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增值率的變化;(4)分離AdMC，分為四個組:對照組、DEX組、DEX+LTD4組和DEX+LTD4+p38抑制劑SB203580組或

13、DEX+LTD4+ERK1/2抑制PD98059組，AnnexinⅤ FITC/PI雙染FCM檢測，觀察CD4+T細(xì)胞和CD8+T早期凋亡率的變化。
　　結(jié)果:(1) Western Blot法檢測顯示，PHA+LTD4組中，LTD4刺激AdMC后5min后，p38磷酸化水平明顯開始增加(P＜0.05)，刺激1小時后，表達(dá)量達(dá)高峰(P＜0.001)，刺激2小時后，表達(dá)量逐漸下降，刺激12小時后，表達(dá)量降至基礎(chǔ)水平，而p38非磷酸化

14、總蛋白的表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。CysLTR1抑制劑montelukast或p38的抑制劑SB203580可抑制該磷酸化反應(yīng)。(2) PHA+LTD4組中，LTD4刺激30min后，ERK1/2磷酸化水平表達(dá)水平顯著增加(P＜0.01)，刺激1小時后，表達(dá)量達(dá)高峰(P＜0.001)，刺激1.5小時后，表達(dá)量逐漸下降，刺激2小時后，表達(dá)量基本降至基礎(chǔ)水平，而ERK1/2非磷酸化總蛋白的表達(dá)在各時間點(diǎn)均無明顯變化(P＞0.05)。C

15、ysLTR1抑制劑montelukast或ERK1/2的抑制劑PD98059可抑制該磷酸化反應(yīng)。(3)LTD4對JNK通路的磷酸化無顯著影響。(4) CFSE標(biāo)記法FCM檢測顯示，PD98059能有效抑制LTD4調(diào)節(jié)的PHA誘導(dǎo)的ADMC中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:(1) LTD4可激活A(yù)dMC中ERK1/2和p38MAPK通路，使其磷酸化水平增加，但對JNK通路無顯著影響。(2) ERK1/2信號通路可能是