JNK信號通路在同型半胱氨酸誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡中的作用.pdf

1、[目的] 1、研究不同濃度同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)凋亡影響,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)特異性抑制劑(SP600125)干預對Hcy誘導的HUVECs凋亡的拮抗作用. 2、探討JNK信號途徑在同型半胱氨酸誘導的HUVECs凋亡可能的作用機制. 3、觀察Hcy誘導的人HUVECs單核細胞趨化蛋白-1(MC

2、P-1)的產生以及SP600125對它的影響. [方法] 1、HUVECs用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),將實驗分八組:正常對照組(A組)、0.1mmol/L Hcy組(B組)、0.3mmol/L Hcy組(C組)、1.0mmol/L Hcy組(D組)、3.0mmol/LHcy組(E組)、10.0mmol/L Hcy組(F組)、10.0mmol/L Hey+1.0umol/1 SP600 125組(G組)和10.0mmo

3、l/L Hcy+10.0umol/1 SP600125組(H組);將G組和H組HUVECs用SP600125預處理1小時后,再用上述各種濃度的Hcy繼續(xù)培養(yǎng)24h,分別利用TUNEL染色方法檢測各組細胞的凋亡情況. 2、應用Western-blot方法檢測各組細胞的JNK的表達,觀察0.1mmol/L及10.0mmol/L Hcy刺激后15min、30min、1h、2h、4h及8h,JNK磷酸化水平隨時間的動態(tài)變化;觀察0.1、

4、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/L Hcy刺激后2h,JNK磷酸化水平隨Hcy刺激濃度的動態(tài)變化;觀察不同濃度SP600125(1.0、10.0 μM)對10.0mmol/LHcy誘導HUVECsJNK磷酸化的影響. 3、應用ELISA方法檢測HUVECs在0.1、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/L Hcy誘導下MCP-1的產生,觀察SP600125(1.0、10.0 μm)對10.0mmol/L Hcy誘導

5、HUVECs釋放MCP-1的影響. [結果] 1、TUNEL染色凋亡檢測方法結果:B組對HUVECs凋亡無影響,與對照組比較無顯著性差異(P>0.05),0.3mmol/L Hcy可以引起明顯細胞凋亡,與對照組比較有顯著性差異(P<0.01),在F組Hcy的促凋亡作用最強,細胞凋亡率達到40.21±1.30﹪.SP600125干預處理能減少細胞凋亡數(shù)目,與相應無SP600125干預組比較有顯著性差異(P<0.0 1),而

6、且SP600125干預組之間比較有顯著性差異(P<0.01). 2、Western Blot檢測Hcy刺激HUVECsJNK磷酸化時間動態(tài)變化:0.1mmol/L刺激時,15rain也明顯磷酸化,持續(xù)至4h,并且隨后JNK磷酸化水平出現(xiàn)下降,高峰發(fā)生在2h,3.00±0.19倍于對照組水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),8h回到接近于對照組水平;10.0mmol/L刺激時,15minJNK明顯磷酸化,持續(xù)至8h,高峰發(fā)生在2

7、h～4h,6.56±0.38倍于對照組水平(P<0.01),2h與4h之間無顯著性差異(P>0.05);兩者均在30min出現(xiàn)了短暫的下降期. 3、不同濃度Hey刺激的HUVECsJNK磷酸化的結果:與Hcy存在明顯的濃度依賴關系,0.1mmol/LHcy時就出現(xiàn)了JNK明顯磷酸化,10.0mmol/L Hcy誘導下JNK最強的活化,相比于對照組,6.11±0.6l倍的升高(P<0.01). 4、不同濃度SP600125

8、抑制Hcy誘導的JNK的磷酸化:SP600125以濃度依賴性的方式抑制Hcy誘導HUVECs中JNK的磷酸化(P<0.01). 5、細胞上清中MCP-1的含量:MCP-1的釋放水平與Hcy存在明顯的濃度依賴關系,10.0mmol/L Hcy誘導下MCP-1水平最高(相比對照組,P<0.01),SP600125干預處理能減少細胞MCP-1的釋放,與相應無SP600125干預組比較有顯著性差異(P<0.01),而且SP600125干

9、預組之間比較有顯著性差異(P<0.01). [結論] 1、Hcy對離體培養(yǎng)的HUVECs增殖具有抑制作用,濃度為0.3mmol/L時即能促進細胞早期凋亡,該作用隨著Hcy濃度的增加而增強,濃度為10.0mmol/L時最顯著;SP600125能拮抗Hcy誘導的HUVECs凋亡作用. 2、Hcy能增強HUVECs的JNK的表達,Hey與JNK的表達呈時間依賴和劑量依賴關系,而且濃度越高持續(xù)時間越久.SP600125則