生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)順式-4-L-羥脯氨酸的研究.pdf

1、順式-4-L-羥脯氨酸（cis-4-Hydroxy proline，cis-4-Hyp）不屬于20種常見的氨基酸，是L-脯氨酸被順式-4-L-羥化酶羥基化修飾后的產(chǎn)物。順式-4-L-羥脯氨酸是合成宜他霉素和微鞘藻素兩種肽類抗生素的原料，并且臨床上被認(rèn)為可做為抗癌藥物，因此cis-4-Hyp的生產(chǎn)和應(yīng)用一直受到業(yè)界的廣泛關(guān)注。目前，國外生產(chǎn)羥脯氨酸的有效生產(chǎn)方法是生物轉(zhuǎn)化法，即利用脯氨酸羥化酶在Fe2+、α-酮戊二酸存在的介質(zhì)中將底物L(fēng)-

2、脯氨酸轉(zhuǎn)化為L-羥脯氨酸。
　　本研究首先通過調(diào)整大腸桿菌的密碼子偏好性以及mRNA二級結(jié)構(gòu)對順式-4-L-脯氨酸(cis-4-proline hydroxylase，cis-P4H)進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的基因連接到載體pET-M-3C上，獲得重組質(zhì)粒pET-cis-P4H。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后獲得重組大腸桿菌BL21(pET-cis-P4H)。采用Ni-NTA親和層析柱分離純化cis-P4H，測定cis-P4H的酶活和穩(wěn)

3、定性。然后采用生物轉(zhuǎn)化法制備cis-4-Hyp，并通過單因素試驗和正交試驗對相關(guān)的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化。對重組大腸桿菌進(jìn)行產(chǎn)cis-P4H的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素試驗和正交試驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件（誘導(dǎo)劑乳糖濃度、接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH和發(fā)酵溫度），然后進(jìn)行5L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴將來源于中華根瘤菌屬的順式-4-L-脯氨酸羥化酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化和全基因合成并構(gòu)建到質(zhì)粒pET-M-3C上，將重

4、組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中BL21-CodonPlus(DE3)中，構(gòu)建了一株產(chǎn)順式-4-L-脯氨酸羥化酶的工程菌。⑵對產(chǎn)順式-4-L-脯氨酸羥化酶的工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并采用Ni-NTA親和層析柱分離純化cis-P4H，測定cis-P4H的酶活和穩(wěn)定性，cis-P4H的酶活為2.65 U/mg，半衰期為2.32h。⑶采用生物轉(zhuǎn)化法制備cis-4-Hyp，并對相關(guān)的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的結(jié)果為:采用OD600為0.9時加入IPTG至濃

5、度0.2 mol/L，28℃下誘導(dǎo)5h后獲得的工程菌菌體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體系，在轉(zhuǎn)化體系pH為6.5，轉(zhuǎn)化溫度為31℃，轉(zhuǎn)化時間為60 h時，L-脯氨酸轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到83.33％。⑷對重組大腸桿菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵研究，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖為20 g/L、酵母浸粉為5g/L、硫酸銨為3g/L、磷酸二氫鉀1g/L、氯化鈉為1.5 g/L、硫酸鎂為0.1 g/L、硫酸亞鐵為0.1 g/L。誘導(dǎo)劑乳糖濃度8g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0，接種量