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文檔簡介
1、利巴韋林(Ribavirin)是一種被廣泛用于治療多種DNA和RNA病毒的藥物。發(fā)酵法合成利巴韋林是利用核苷生產(chǎn)菌自身產(chǎn)生前體物鳥苷和嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,由pupG基因編碼),向培養(yǎng)基中添加1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺(TCA)即可生成利巴韋林。
本論文先對本實驗室保存利巴韋林生產(chǎn)菌進行發(fā)酵工藝優(yōu)化。生產(chǎn)菌Bacillusamyloliquefaciens TA208-LM是腺嘌呤缺陷型突變株,腺嘌呤濃度過低會
2、影響菌體生長,過高又會反饋阻遏關鍵酶的合成。首先對腺嘌呤供體的種類和用量進行了研究,搖瓶發(fā)酵結果表明Springer2506是最佳的腺嘌呤供體,用量在15 g/L時最有利于利巴韋林積累,但發(fā)酵后期腺嘌呤濃度過高。因此在降低Springer2506的初始濃度的基礎上,額外添加腺嘌呤,結果發(fā)現(xiàn)初始腺嘌呤總量為47.95 mg/L時,發(fā)酵液中腺嘌呤含量維持在40~50 mg/L,PRPP轉酰胺酶活力最高,合成利巴韋林的量最大。以上實驗表明,控
3、制腺嘌呤供體酵母抽提物的初始用量,在發(fā)酵過程中流加酵母抽提物可能是維持適宜腺嘌呤濃度的有效手段。在7.5 L發(fā)酵罐上對Springer2506分批補料發(fā)酵方式進行研究,結果發(fā)現(xiàn)以7.5 g/L Springer2506為底物,流加7.5 g/L的Springer2506,比一次性添加15 g/L的Springer2506,利巴韋林的積累量提高11.29%。
工程菌B.amyloliquefaciens TA208-LM有一個大
4、質(zhì)粒pBSA43-pupG用來加強嘌呤磷酸化酶催化鳥苷生成利巴韋林的途徑,但它會導致工程菌生長緩慢,不利于利巴韋林積累。因此,利用更小的質(zhì)?;蚴腔蛘系姆椒p少菌體生長負擔,并從基因水平上提高PNPase在宿主中的表達量,來提高利巴韋林產(chǎn)量。
本論文考察PNPase質(zhì)粒(pWB980)過表達和基因組整合表達對Bacillusamyloliquefaciens TA208發(fā)酵生產(chǎn)利巴韋林的影響。以TA208為出發(fā)菌株,利用基因
5、過表達成功構建了胞內(nèi)表達TA2081和胞外表達TA2082;搖瓶發(fā)酵結果,胞外表達TA2082比胞內(nèi)TA2081更適合作為利巴韋林生產(chǎn)菌。以TA208為出發(fā)菌株,利用基因無標記整合技術,成功構建了TA2083;搖瓶發(fā)酵結果表明,TA2083較原菌TA208利巴韋林產(chǎn)量提高了58.3%,但前體物鳥苷還有大量剩余,表明基因組上pupG拷貝數(shù)不夠?qū)е翽NPase酶活力不足。進一步對B.amyloliquefaciens TA208、TA208
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