微生物細(xì)胞催化合成γ-氨基丁酸效能強(qiáng)化的研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是谷氨酸(Glutamic acid，Glu)經(jīng)谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)催化脫羧生成的產(chǎn)物。GABA作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜安神、利尿、降血壓等多種生理功能，可作為生物活性因子應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)。此外，GABA還可作為前體物質(zhì)來合成聚酰胺-4（可生物降解材料）等化工產(chǎn)品。本研究采用基因工程手段和

2、細(xì)胞透性化技術(shù)對(duì)GABA高產(chǎn)茵Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306和GAD工程菌BL21(DE3)-pET28a-gadB的GABA合成能力進(jìn)行強(qiáng)化研究，并在此基礎(chǔ)上，將谷氨酸脫羧反應(yīng)與乳酸發(fā)酵進(jìn)行耦合來同時(shí)制備GABA和乳酸，主要結(jié)果如下:
　　1.以Lb.brevis CGMCC NO.1306為研究對(duì)象，采用增加其GABA合成系統(tǒng)關(guān)鍵基因所在操縱子拷貝數(shù)的方式來提高其GABA合成能力。對(duì)Lb.b

3、revisCGMCC NO.1306基因組中涉及GABA合成的兩個(gè)操縱子(gadRAC operon和gadB operon)進(jìn)行了克隆和序列測定，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)操縱子與Lb.brevis ATCC367相關(guān)序列的同源性都高達(dá)99％。利用熒光定量PCR技術(shù)考察了在控酸發(fā)酵條件下Lb.brevis CGMCC NO.1306 GABA合成系統(tǒng)中各個(gè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)該菌GABA合成能力與gadRCA操縱子上的GAD抗酸系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子g

4、adR、GAD基因gadA和Glu-GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因gadC的表達(dá)水平成正相關(guān)，而單獨(dú)處于另一操縱子的GAD基因gadB的表達(dá)則與菌體GABA合成能力關(guān)系不大。在Lb.brevis CGMCC NO.1306中增加gadR CA操縱子的拷貝數(shù)后，工程菌的表觀GAD催化活力較原始菌得到明顯提高，且其活性在各個(gè)時(shí)期都明顯高于同期原始菌。發(fā)酵24 h時(shí)，工程菌表觀GAD活力達(dá)到最大值為0.86 U/mg，是同期原始菌的1.23倍。

5、r>　　2.以BL21(DE3)-pET28a-gadB為研究對(duì)象，在其內(nèi)強(qiáng)化Glu-GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因gadC的表達(dá)，可以有效地促進(jìn)底物Glu和產(chǎn)物GABA進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，從而削弱了細(xì)胞被膜對(duì)底物和產(chǎn)物跨膜運(yùn)輸?shù)膫髻|(zhì)阻力，重組子BL21(DE3)-pET28a-gadBC的表觀GAD催化活力較BL21(DE3)-pET28a-gadB的提高了2.6倍。但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)Glu-GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過量表達(dá)會(huì)對(duì)菌體生長產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制

6、效應(yīng)，從而削弱了菌體表觀GAD催化活力提高的正效應(yīng)，表現(xiàn)為單位體積BL21(DE3)-pET28a-gadBC發(fā)酵液中菌體的總表觀GAD催化活力只比單位體積BL21(DE3)-pET28a-gadB發(fā)酵液的提高了1.39倍。
　　3.采用有機(jī)溶劑、表面活性劑、細(xì)胞壁合成抑制劑、熱處理和表達(dá)膜激肽（麥芽糖-蛙皮素融合蛋白）等多種細(xì)胞透性化方法來削弱BL21(DE3)-pET28a-gadB細(xì)胞被膜對(duì)底物和產(chǎn)物跨膜運(yùn)輸?shù)膫髻|(zhì)阻力，從而

7、為其表觀GAD催化活力的改善尋求了更為有效的方法。(1)采用有機(jī)溶劑對(duì)BL21(DE3)-pET28a-gadB進(jìn)行透性化處理時(shí)，有機(jī)溶劑的疏水性與菌體表觀GAD活力提高倍數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，最有效的有機(jī)溶劑已烷在優(yōu)化的處理?xiàng)l件下(1％己烷處理菌體5min)，可使菌體表觀GAD活力提高9.65倍;(2)在所用的表面活性劑中，Triton X-100能最為有效地提高BL21(DE3)-pET28a-gadB的表觀GAD催化活力，1％ Trito

8、nX-100處理菌體5min，可使菌體表觀GAD活力提高10.8倍;(3)當(dāng)用5μg/mL氨芐青霉素對(duì)BL21(DE3)-pET28 a-gadB進(jìn)行透性化處理時(shí)，菌體表觀GAD催化活力可以提高6.42倍，但該方法會(huì)導(dǎo)致菌體生物量降低40.3％;(4)70℃條件下熱處理BL21(DE3)-pET28a-gadB菌體30 min，可使菌體表觀GAD催化活力提高13.05倍，達(dá)到9.08U/mg（細(xì)胞干重），且沒有出現(xiàn)GAD泄露現(xiàn)象;(5)

9、表達(dá)麥芽糖-蛙皮素融合蛋白的透性化方法對(duì)BL21(DE3)-pET28a-gadB的表觀GAD催化活力沒有明顯改善效果。由于熱處理可以最為有效的改善BL21(DE3)-pET28a-gadB菌體的表觀GAD催化活力，同時(shí)熱處理不需要添加處理試劑，可以避免有毒物質(zhì)的引入，且易于操作和放大，因此選擇在70℃處理菌體30 min作為制備BL21(DE3)-pET28 a-gadB菌體催化劑的透性化處理方式。
　　4.采用海藻酸鈉-CaC

10、12法對(duì)經(jīng)熱處理制備的透性化BL21(DE3)-pET28a-gadB菌體進(jìn)行固定化，在菌體密度為9.28 mg/mL、pH4.8、溫度50℃、50 mM CaCl2和0.1 mMPLP的條件下，固定化細(xì)胞經(jīng)過20批次共80 h反應(yīng)后，其相對(duì)轉(zhuǎn)化率能保持在最初的60％以上。將固定化細(xì)胞存放在4℃的無菌水中，其催化活力在一個(gè)月后仍能保持在90％以上。
　　5.將固定化BL21(DE3)-pET28a-gadB菌體催化的Glu脫羧反應(yīng)