脂蛋白（a）對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞間粘附因子-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的: 系膜增殖性腎炎(Mesangial proliferativeglomerulonephritis，MsPGN)是小兒原發(fā)性腎小球疾病的主要病理類型之一，其主要病理變化為腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells，GMCs)增殖及系膜基質(zhì)增生，GMCs的增殖可導(dǎo)致腎小球系膜病變不斷加重，最終腎小球硬化、腎功能喪失。近年來(lái)研究表明腎小球硬化與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis：AS)在病

2、理上的改變及發(fā)病機(jī)理上存在相似性。脂質(zhì)代謝紊亂在AS獨(dú)立危險(xiǎn)因素中居首要地位，亦是腎小球系膜病變進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)在腎小球硬化形成中有重要作用，能直接刺激GMCs增殖和基質(zhì)增多致腎小球硬化形成。 脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]是一種富含膽固醇、類似LDL的脂質(zhì)。研究表明Lp(a)水平升高是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Lp

3、(a)在體內(nèi)被氧化修飾后，易被巨噬細(xì)胞-清道夫受體識(shí)別和攝取，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的蓄積及泡沫細(xì)胞的形成，損傷組織細(xì)胞，參與AS的病理過(guò)程。Lp(a)在腎病綜合征患兒明顯升高，且與患兒病情進(jìn)展密切相關(guān)，提示Lp(a)可能在腎小球硬化中起一定作用。GMCs具有巨噬細(xì)胞樣清道夫功能，Lp(a)是否作用于GMCs而參與腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展值得研究。最近研究發(fā)現(xiàn)腎臟病時(shí)Lp(a)升高可能會(huì)導(dǎo)致腎臟的進(jìn)一步損傷。但Lp(a)對(duì)GMCs有無(wú)作用及可能

4、機(jī)制尚未見(jiàn)研究。細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)是一類能介導(dǎo)細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的糖蛋白，ICAM有5種，ICAM-1是其中重要的一種，在AS發(fā)病中起著一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)粘附分子及其粘附機(jī)理可能是介導(dǎo)腎炎時(shí)細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖、細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張乃至腎小球硬化的分子基礎(chǔ)。GMCs表面有低表達(dá)的工CAM-1。Lp(a)對(duì)GMCs表面ICAM-1表達(dá)是否有影響，它在GMCs增殖、腎

5、小球硬化過(guò)程中的作用值得進(jìn)一步研究。 本項(xiàng)目正是借助脂蛋白是AS獨(dú)立危險(xiǎn)因素，引入研究Lp(a)對(duì)GMCs增殖、ICAM-1的表達(dá)及腎小球硬化過(guò)程中的作用，為探尋治療腎小球疾病的新途徑提供科學(xué)依據(jù)。 方法: 1.大鼠GMCs培養(yǎng)：從液氮罐內(nèi)取出大鼠GMCs系冷凍管，37℃溫水水浴后離心，吸出細(xì)胞液，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液由20％胎牛血清、0.3U/ml胰島素、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素、

6、2.5mg/L二性霉素及D-纈氨酸改良的伊格爾培養(yǎng)基(Minimum Essential Medium，MEM)組成。培養(yǎng)瓶置于5％CO<,2>、18％O<,2>孵箱內(nèi)。當(dāng)系膜細(xì)胞長(zhǎng)至貼壁時(shí)，用0.25％胰蛋白酶與0.04％乙二胺四乙酸二鈉等量混合，消化細(xì)胞，傳代。第3代時(shí)，用RPMI 1640代替D-纈氨酸改良的MEM，其他成分相同。 2.Lp(a)分離：通過(guò)采集定期進(jìn)行LDL血漿置換患者的富含Lp(a)再生液，行超速離心(

7、密度1.065-1.120mg/ml)，再予密度梯度離心法分離。獲取的Lp(a)經(jīng)150mmol/L NaCl、lmmol/L EDTA(pH 7.4)于4℃透析48h后，微孔過(guò)濾膜除菌，Sephader G 25M凝膠層析和賴氨酸-seppharose 4B層析純化，采用0.6％瓊脂糖凝膠電泳和4％的SDS-PAGE鑒定并分析純度。儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?3.MTT法測(cè)定大鼠GMCs增生率：將GMCs種入96孔板中，(2～4)×10<'

8、4>個(gè)細(xì)胞/孔，分對(duì)照組、10mg/L脂多糖(LPS)組、Lp(a)共3組，Lp(a)濃度分別為：1.25μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L。分別于培養(yǎng)12h、24 h、48 h、60h、72h 5個(gè)時(shí)間段后，收集培養(yǎng)的GMCs及懸浮液，分別測(cè)定GMCs增生率。細(xì)胞增生率=(LPS組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度)/LPS組吸光度。 4.GMCs中增生細(xì)胞核抗原(Proliferationg celln

9、uclear antigen，PCNA)表達(dá)的測(cè)定：GMCs分瓶培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)?zāi)占囵B(yǎng)細(xì)胞，涂片，丙酮固定，免疫組化法測(cè)定PCNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在顯微鏡下觀察，分別計(jì)數(shù)每張涂片中的5個(gè)視野內(nèi)(200個(gè)/每視野)GMCs的免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其陽(yáng)性率。 5.ICAM-1的測(cè)定：采用ELISA法(試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司)。兩種抗ICAM-1的抗體將ICAM-1夾在中間，其中第二抗體與指示酶連接，加入色素性底物使一定

10、量的ICAM-1顯色，最后在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定ICAM-1的濃度。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組問(wèn)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，并行相關(guān)分析。以p<0.05為有統(tǒng)計(jì)意義。 結(jié)果 1.在實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與LPS組、對(duì)照組比較，Lp(a)組GMCs的MTT、增生細(xì)胞核抗原陽(yáng)性表達(dá)率、上清ICAM-1濃度明顯高于對(duì)照組，但低于LPS組。 2.隨著Lp(a)劑量的增加，GMCs的MTT、增生細(xì)胞核

11、抗原陽(yáng)性表達(dá)率、上清工CAM-1濃度呈增加趨勢(shì)，在Lp(a)2.5μg/L、5.0μg/L其作用達(dá)到高峰，劑量繼續(xù)增加時(shí)出現(xiàn)下降，劑量越大，GMCs的增生受抑制越明顯。 3.隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GMCs的MTT、增生細(xì)胞核抗原陽(yáng)性表達(dá)率、ICAM-1濃度呈增加趨勢(shì)，但隨著劑量的增加，依次于72h、60h、48h逐漸出現(xiàn)下降。 4.GMCs上清的ICAM-1濃度與MTT和增生細(xì)胞核抗原陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)。 結(jié)論

12、 1.Lp(a)能明顯影響腎臟系膜細(xì)胞的增生，作用呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，小劑量時(shí)刺激系膜細(xì)胞的增生，大劑量則表現(xiàn)為細(xì)胞毒作用。 2.Lp(a)明顯影響大鼠GMCs的ICAM-1表達(dá)，表達(dá)量呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，小劑量時(shí)Lp(a)上調(diào)大鼠GMCs的ICAM-1表達(dá)，大劑量時(shí)，大鼠GMCs的ICAM-1表達(dá)下調(diào)。 3.GMCs上清的ICAM-1濃度與MTT和增生細(xì)胞核抗原陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)。提示Lp(a)對(duì)腎小球