豬流行性腹瀉病弱毒疫苗YN-144株的制備與臨床評估.pdf

1、豬流行性腹瀉?。╬orcine epidemic diarrhea，PED）可引起產(chǎn)房哺乳仔豬大規(guī)模死亡，耐過豬只飼料報酬率下降，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失。尤其是2010年冬季以來，我國大范圍爆發(fā)產(chǎn)房仔豬腹瀉，發(fā)病率及死亡率均很高，造成上百萬頭哺乳仔豬的死亡，造成了巨大損失。2013年4月至今，其對美國、韓國的養(yǎng)豬業(yè)也造成了極大沖擊，此次爆發(fā)被證實主要由PEDV變異毒株引起。該病用藥效果不佳，疫苗免疫和生物安全措施是最好的防控方法。我國常用

2、的商品滅活疫苗和弱毒疫苗，均主要使用傳統(tǒng)PEDV CV777經(jīng)典毒株制備，與目前臨床廣泛流行的變異毒株不匹配，保護(hù)效果有限。免疫過CV777疫苗的豬場仍然爆發(fā)PED的現(xiàn)象越來越普遍，且多使用肌肉注射免疫，操作復(fù)雜。
　　本實驗室成功從2013年嚴(yán)重腹瀉仔豬小腸組織分離了一株P(guān)EDV YN-1流行變異毒株，并在Vero細(xì)胞系上連續(xù)傳代培養(yǎng)144代后得到Y(jié)N-144株。全基因組測序發(fā)現(xiàn)與YN低代次毒株比較，S基因有多個氨基酸的改變和缺

3、失，ORF3基因提前終止，這些變化與韓國DR13野毒株和其疫苗毒株之間的變化相似。動物試驗發(fā)現(xiàn)YN-144致病力減弱，不能引起仔豬出現(xiàn)腹瀉等癥狀，提示其作為變異毒株弱毒疫苗候選株的可能。
　　本試驗通過真空冷凍干燥技術(shù)將 YN-144弱毒株制成弱毒疫苗，在豬場使用并評價其免疫效力和安全性，掌握抗體變化規(guī)律，比較不同免疫途徑。并應(yīng)用到臨床發(fā)病豬場，評價緊急控制和預(yù)防效果，為該疫苗臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要內(nèi)容如下：
　　1.PED

4、V YN-144弱毒凍干疫苗制備
　　疫苗毒接種于添加10μg/mL胰酶的Vero細(xì)胞，孵育9h即可觀察到細(xì)胞病變（CPE），孵育18-24h出現(xiàn)明顯病變，收獲的疫苗毒毒價維持在105.0-106.0TCID50/0.1mL。優(yōu)化凍干保護(hù)劑及程序，確定病毒液與明膠之比為7：1；凍干程序為病毒液-80℃預(yù)冷6h，冷阱預(yù)冷2h致-55℃，真空冷凍干燥24-36h。凍干后毒價維持在105.0-105.5TCID50/0.1mL，凍干后疫

5、苗形態(tài)良好，質(zhì)地均一。
　　2.疫苗免疫效力評估
　　在無PED流行史的豬場應(yīng)用本疫苗，分為弱毒疫苗組（口服、肌注）和滅活疫苗肌注組。弱毒疫苗分別通過拌料口服、后海穴肌肉注射YN-144疫苗（105.5TCID50/頭），滅活疫苗組后海穴注射商品滅活苗1頭份。結(jié)果顯示，YN-144弱毒疫苗經(jīng)口服與肌注免疫，刺激產(chǎn)生的抗體水平差異不顯著；與滅活疫苗相比，活疫苗可刺激產(chǎn)生更高水平的乳汁IgA抗體和乳汁、仔豬血清中和抗體。弱毒疫苗

6、口服組、弱毒疫苗肌注組和滅活疫苗肌注組的初乳中IgA S/P值分別為0.893、0.918和0.640；弱毒疫苗口服組和滅活疫苗組免疫母豬的初乳和7日齡仔豬血清中和抗體滴度分別為1：1505（210.56）、1：953（29.90）和1：258（28.01）、1：114（26.83）。YN-144弱毒疫苗口服和肌注均有較好的免疫效力。
　　3.疫苗臨床安全性評估
　　將YN-144弱毒疫苗免疫22頭母豬（105.5TCID5

7、0/頭），每日觀察母豬和所產(chǎn)仔豬臨床癥狀，均表現(xiàn)正常，未發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)、腹瀉等異常癥狀。弱毒疫苗口服組、肌注組和滅活疫苗肌注組窩均健仔數(shù)和仔豬初生均重分別為9.71頭、9.67頭和9.50頭，1.63Kg、1.61Kg和1.46Kg，弱毒疫苗組與滅活疫苗組無顯著差別。常規(guī)RT-PCR與熒光定量 RT-PCR未從母豬和仔豬糞便中檢測到疫苗毒株。說明 YN-144弱毒疫苗安全性較好。
　　4. PED診斷與疫苗臨床應(yīng)用
　　某規(guī)?；i

8、場產(chǎn)房仔豬出現(xiàn)水樣灰黃色糞便，部分仔豬嘔吐，1周內(nèi)全部發(fā)病，死亡率約90％。通過臨床診斷和實驗室診斷，確診為PEDV變異野毒株感染，伴有PCV2混合感染。為迅速控制該病，使用YN-144弱毒疫苗全群免疫各階段母豬，使用抗PEDV卵黃抗體緊急被動免疫已經(jīng)出生的仔豬，迅速控制疫情。對比試驗中發(fā)現(xiàn)，弱毒疫苗組的初乳中和抗體和仔豬7天存活率極顯著高于滅活疫苗組（P<0.01），分別為1：351（28.45）、1：4和99.3%、75.7%。說明