老齡小鼠胸腺輻射損傷效應(yīng)和分子機制的研究.pdf

1、目的：
　　胸腺是免疫系統(tǒng)中重要的中樞免疫器官，是T淋巴細胞分化、發(fā)育、成熟為的場所和自身免疫耐受的中心，并且分泌多種肽類激素參與免疫調(diào)節(jié)。青春期后胸腺隨著年齡增長發(fā)生明顯萎縮的現(xiàn)象，稱為增齡性胸腺萎縮。其特征為腺體變小，重量減輕，細胞結(jié)構(gòu)破壞，脂肪細胞積累，胸腺細胞增殖能力下降。增齡性胸腺萎縮主要由胸腺微環(huán)境的改變所引起，胸腺微環(huán)境是一個高度異質(zhì)性的三維網(wǎng)絡(luò)，主要由胸腺基質(zhì)細胞(TSC)和胸腺細胞兩部分構(gòu)成，TSC主要是胸腺上皮

2、細胞(TEC)，胸腺細胞即胸腺內(nèi)的淋巴細胞。TEC可通過兩種方式促進胸腺細胞的發(fā)育，其一，分泌細胞因子促進胸腺細胞的增殖和分化，胸腺細胞在胸腺皮質(zhì)內(nèi)會受到細胞因子的廣泛影響，這些細胞因子是誘導(dǎo)胸腺細胞亞群的克隆增殖、分化和成熟過程所必需的。其二，TEC與胸腺細胞的接觸，兩者表面的受體與配體相互作用，導(dǎo)致胸腺細胞增殖和發(fā)育。到了中老年，增齡性胸腺萎縮比較嚴重，胸腺細胞發(fā)生明顯的退行性改變和凋亡，造成外周淋巴組織中T細胞的質(zhì)與量的異常，因而

3、增齡性胸腺萎縮勢必導(dǎo)致免疫系統(tǒng)衰老和應(yīng)答免疫系統(tǒng)功能低下，一方面增加老年人罹患癌癥、病毒細菌等病原感染的危險，另一方面降低老年人對外源性損傷，如放療輻射、腫瘤化療、應(yīng)激刺激等的修復(fù)能力。
　　近年來惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率在國內(nèi)、國外均呈明顯的上升趨勢，人口老齡化是主要原因之一。放療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，惡性腫瘤病人中約有70％在其治療的不同階段需要接受放療，因此老年人接受放療輻射的機會多于中青年人。胸腺是輻射高度敏感器官

4、，胸部腫瘤（如乳腺癌、肺癌、食道癌、霍奇金淋巴瘤、畸胎瘤等）的放療不可避免的造成胸腺輻射損傷而且非常多見。
　　近年來胸腺輻射損傷效應(yīng)的研究主要集中不同劑量的輻射對胸腺的損傷效應(yīng)，涉及眾多而復(fù)雜的分子調(diào)控系統(tǒng)。文獻報道，0.5Gy以上的輻射即可引起人胸腺細胞歸巢能力下降;胸腺細胞計數(shù)下降;DNA合成受抑制;胸腺細胞凋亡增加，促進凋亡的蛋白分子表達升高等，并隨輻射劑量呈依賴性加重。輻射對TEC損傷的機制不十分清楚，文獻報道輻射后可引

5、起細胞信號通路的激活（如PDE7/Camp/PKA途徑）或受阻（Notch信號通路）、細胞因子IL-2、CSF、TNF等分泌異常，隨輻射劑量不同反應(yīng)不同。近年發(fā)現(xiàn)一些新的胸腺微環(huán)境在特定階段表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、細胞因子，它們參與調(diào)節(jié)胸腺的成熟、老化及胸腺細胞的分化、發(fā)育、增殖過程。例如，F(xiàn)oxn1轉(zhuǎn)錄因子在皮膚和胸腺上皮細胞所表達，是胸腺的器官發(fā)生過程中的TEC的分化和增殖所必須的。Foxn1基因的缺失在人和小鼠中都導(dǎo)致了嚴重的胸腺缺失

6、和免疫缺陷。 Foxp3轉(zhuǎn)錄因子大部分表達于胸腺CD4+CD25+Treg細胞亞群。Treg是機體維持自身免疫穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，在抗感染免疫、腫瘤免疫、免疫排斥、免疫抑制發(fā)生及自身免疫性疾病等方面都起著非常重要作用。Foxp3決定了Treg細胞的免疫抑制功能。阻斷Foxp3表達后，Treg細胞的抑制功能明顯減低。白細胞介素-7(IL-7)最早是骨髓基質(zhì)細胞分泌的一種糖蛋白，也表達與胸腺。近年來的體內(nèi)體外實驗已經(jīng)證明IL-7不僅是早期B

7、細胞的生長因子，也是胸腺早期T細胞的維持生長因子。角質(zhì)細胞生長因子(KGF)屬于成纖維細胞生長因子家族，KGF具有廣泛的生物學(xué)活性，能促進多種細胞中DNA的合成，能特異性地刺激上皮細胞增殖和生長。KGF是出生后小鼠胸腺再生的必需因素。在很多疾病模型中，KGF可以通過增加TEC數(shù)量以及恢復(fù)胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)而發(fā)揮保護胸腺的功能。目前，這些因子在胸腺輻射后的表達規(guī)律鮮有報道，對輻射損傷的調(diào)節(jié)作用有待進一步研究。
　　綜上，我們推測老年

8、人由于增齡性胸腺萎縮引起機體免疫功能下降，對外源性損傷的耐受、修復(fù)能力降低，因此胸腺輻射損傷效應(yīng)可能不同于中青年人。
　　本課題擬通過四部分實驗研究老齡小鼠胸腺輻射損傷效應(yīng)及分子機制。一、監(jiān)測輻射前后老齡、中齡、青齡小鼠胸腺輸出的成熟T細胞及幼稚T細胞的動態(tài)變化，二、觀察輻射前后老齡、中齡、青齡小鼠胸腺的大體及病理形態(tài)學(xué)變化。三、動態(tài)比較輻射前后老齡、中齡、青齡小鼠胸腺TEC轉(zhuǎn)錄因子Foxn1、Foxp3和細胞因子IL-7、KGF

9、的表達差別。四、比較輻射前后老齡、中齡、青齡小鼠TEC的分化和增殖能力及不同成熟階段的胸腺細胞的變化規(guī)律。通過以上實驗，明確老齡小鼠胸腺亞致死性輻射對機體免疫功能的損傷程度及自身的修復(fù)規(guī)律，從細胞和分子水平上明確了輻射后胸腺組織損傷和重建的變化規(guī)律，闡明胸腺輻射損傷與修復(fù)的分子機制，為輻射后免疫功能的重建和研究有效的防治措施，促進老齡人口健康提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、實驗動物分組
　　實驗采用SPF

10、級C57BL/6小鼠共60只。分為三組:青齡組（4月齡）、中齡組(12月齡)、老齡組(18月齡)，每組20只。
　　二、標本的采集與處理
　?。ㄒ唬┬∈蟮妮椛?。
　　取青齡組、中齡組、老齡組各10只，稱重，腹腔麻醉后，予胸腺區(qū)醫(yī)用直線加速器放療輻射。放療參數(shù):胸腺區(qū)照射野1.5×1.5cm2，源皮距100cm，X線輻射，劑量4Gy，加速器劑量率300cGy/分鐘。輻射后SPF級飼養(yǎng)室內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，分籠標記。
　　（

11、二）小鼠的取材、處理
　　選取未輻射及輻射后3天、14天青齡組、中齡組、老齡組各5只，給予10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，無菌取胸腺及脾臟組織，提取胸腺細胞、胸腺上皮細胞、脾臟中的淋巴細胞，進一步實驗。
　　三、試驗方法及檢測指標
　?。ㄒ唬┬∈笃⑴KT細胞FACS分析
　　采用FACS分析輻射前及輻射后3天、14天各年齡組小鼠脾臟CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD44-CD62+T細胞亞群數(shù)量、比例

12、變化。
　?。ǘ┬∈笮叵俳M織HE染色
　　選取輻射前及輻射后3天、14天各年齡組小鼠胸腺組織各1葉予HE染色。顯微鏡下觀察胸腺組織形態(tài)學(xué)改變。
　?。ㄈ┯嬎阈叵僦笖?shù)及胸腺細胞計數(shù)
　　小鼠稱其體重及胸腺重量，按公式計算胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/[體重(g)×10]。分離收集胸腺細胞，加入500μl PBS混勻，顯微鏡下計數(shù)。
　?。ㄋ模┬∈笮叵偌毎鸉ACS分析
　　采用FACS分析輻射

13、前及輻射后3天、14天各年齡組小鼠胸腺細胞CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD4+CD8+、CD4-CD8-各亞群數(shù)量、比例變化。
　　結(jié)果：
　　一、老齡、中齡、青齡組小鼠胸腺輻射前后脾臟T細胞FACS分析結(jié)果
　?。ㄒ唬┹椛淝昂罄稀⒅?、青齡小鼠脾臟CD4+T細胞、CD8+T細胞百分含量和CD4+/CD8+比值。
　　1、輻射前小鼠4月、12月、18月齡間相比，脾臟CD4+T細胞和CD8+T細胞百分含量無差

14、異。脾臟CD4+/CD8+比值逐漸降低(P＜0.05)。
　　2、輻射后3天與輻射前相比，各年齡組的CD4+T細胞和CD8+T細胞百分含量均明顯下降（P＜0.05），至輻射后14天，都有不同程度回升，但18月齡組回升不明顯，仍未恢復(fù)至輻射前水平(P＜0.05)。
　?。ǘ┹椛淝昂罄稀⒅?、青齡小鼠脾臟CD4+和CD8+的na(i)ve T細胞(CD62+CD44-)百分含量。
　　1、輻射前4月、12月、18月齡間小鼠

15、脾臟CD4+和CD8+的naive T細胞百分含量隨年齡增長逐漸降低。
　　2、輻射后3天與輻射前相比，各年齡組的CD4+和CD8+的naive T細胞百分含量均明顯下降。至輻射后14天，都有不同程度回升，但12月齡、18月齡組CD4+的naive T細胞和18月齡組CD8+的naive T細胞回升不明顯，仍未恢復(fù)至輻射前水平(P＜0.05）。
　　二、胸腺輻射前后老齡、中齡、青齡組小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)結(jié)果
　　（一）輻

16、射前后老齡、中齡、青齡組小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)的變化
　　小鼠年齡的增加，胸腺組織明顯逐漸萎縮，顏色由乳白變黃白、表面光澤度下降。HE染色圖片，可見隨著年齡的增加，小鼠胸腺皮質(zhì)變薄，細胞稀疏，皮髓質(zhì)分界不清，脂肪組織浸潤。輻射后3天，各年齡組小鼠胸腺組織均進一步明顯萎縮。HE染色圖片見年齡組小鼠胸腺均可見皮髓質(zhì)細胞變形壞死，胸腺內(nèi)淋巴細胞減少，胸腺小體消失。輻射后14天，小鼠胸腺組織體積逐漸增大，HE染色圖片見部分區(qū)域開始再生，但18

17、月齡小鼠胸腺組織恢復(fù)不明顯。
　　（二）輻射前后老齡、中齡、青齡組小鼠胸腺指數(shù)及胸腺細胞計數(shù)的變化
　　小鼠隨著年齡增長，胸腺指數(shù)及胸腺細胞計數(shù)逐漸下降。輻射后3天，各年齡組與輻射前比較，進一步降低(P＜0.05）。輻射后14天，4月齡及12月齡組恢復(fù)接近輻射前水平，但18月齡組恢復(fù)不明顯(P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、小鼠胸腺輻射后，機體的免疫功能經(jīng)歷損傷與重建的過程。但與中、青齡相比，老齡小鼠對輻射損

18、傷的耐受、修復(fù)能力差，存在明顯的遠后效應(yīng)。
　　2、小鼠胸腺輻射后胸腺微環(huán)境也經(jīng)歷缺陷、修復(fù)的過程，但老齡鼠對輻射損傷明顯，輻射后胸腺微環(huán)境未見明顯改善。
　　3、老齡鼠胸腺輻射效應(yīng)機制是:1）輻射使CD4-CD8-的胸腺細胞發(fā)育持續(xù)阻滯，使成熟的、功能性胸腺細胞減少，導(dǎo)致輸出外周的成熟T細胞減少，機體免疫功能持續(xù)低下。2）輻射后Foxn1、Foxp3、KGF、IL-7基因在不同時間段差異表達，動態(tài)調(diào)節(jié)TEC的增殖、凋亡及胸