谷物樣品中基于抗獨(dú)特型納米抗體噬菌體的玉米赤霉烯酮超靈敏熒光定量PCR方法的建立.pdf

1、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是一種在食品中常見的真菌毒素，主要由禾谷鐮刀菌，大刀鐮刀菌，木賊鐮刀菌等產(chǎn)生。ZEN具有廣泛毒性，包括致畸性、致癌性、基因毒性、肝毒性，并可引起免疫抑制和生殖問題。對(duì)食品中的ZEN開展快速檢測(cè)對(duì)于保障食品安全具有重要意義。
　　本研究以抗ZEN單克隆抗體為配基，投入羊駝的天然噬菌體展示納米抗體庫，采用固相淘選的方法，獲得了可特異性結(jié)合ZEN抗體的抗獨(dú)特型納米抗體，將其作為ZEN全抗原的

2、替代物，結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，建立了基于噬菌體展示納米抗體的熒光定量PCR檢測(cè)ZEN的方法；通過分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了納米抗體的原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了所獲納米抗體的可溶性表達(dá)，為實(shí)現(xiàn)基于納米抗體的ZEN全抗原生物合成及無害化替代提供了基礎(chǔ)，主要研究?jī)?nèi)容和成果如下：
　　1.采用生物淘選方法篩選得到2種ZEN抗獨(dú)特型納米抗體序列，分別命名為Z1、Z6，并分別建立了基于Z1、Z6的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其IC50分別為0.25±0.02 ng/mL

3、，0.49±0.03 ng/mL，其靈敏度與化學(xué)合成抗原（ZEN-BSA）相比分別提高了26倍和13倍。
　　2.選取所淘選到的噬菌體納米抗體克隆Z1，以噬菌體粒子為DNA模板，針對(duì)噬菌體質(zhì)粒VHH片段設(shè)計(jì)特異性引物，建立了基于噬菌體克隆Z1的熒光定量PCR方法（PD-IPCR），該方法的最低檢測(cè)限為6.5 pg/mL，線性范圍為0.01~100 ng/mL，變異系數(shù)（CV）5.51~28.12％，與三種常見的真菌毒素AFB1，

4、DON和OTA的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種谷物樣本的加標(biāo)回收率為78~122.4%。分別采用PD-IPCR和LC-M對(duì)玉米、小麥和大米共35個(gè)實(shí)際樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種方法的線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.993。
　　3.采用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了納米抗體的原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及鎳柱純化后，獲得可溶性的ZEN抗獨(dú)特型納米抗體BMP-Z1和BMP-Z6，實(shí)現(xiàn)了基于納米抗體的ZEN全抗原生物合成