玉米赤霉烯酮一步無毒競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法的初步建立及其噬菌體結(jié)合肽的篩選.pdf

1、目的:利用玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)單抗及其抗獨(dú)特型單抗,建立一步無毒免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù);利用噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫(kù)淘選出與ZEN單抗1G4不同識(shí)別位點(diǎn)的ZEN結(jié)合肽,初步驗(yàn)證其用于建立夾心ELISA法的可行性。
　　方法:(1)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期研制的ZEN單抗細(xì)胞株1G4及其抗獨(dú)特型單抗細(xì)胞株1D5克隆化,篩選出分泌高親和力抗體的細(xì)胞株,并制備其腹水型抗體。包被抗獨(dú)特型單抗1D5,與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的ZEN

2、單抗1G4建立一步競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)ZEN的無毒檢測(cè)。(2)包被抗獨(dú)特型抗體1D5,與待測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗1G4,以魯米諾-辣根過氧化物酶-過氧化氫為檢測(cè)系統(tǒng),建立一步競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA),并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行初步優(yōu)化。(3)以ZEN-1G4抗原抗體復(fù)合物為靶分子,對(duì)噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫(kù)進(jìn)行3輪免疫親和篩選;分別以ZEN-1G4復(fù)合物或1G4為包被物,夾心ELISA篩選出與1G4識(shí)別不同位點(diǎn)的ZE

3、N結(jié)合肽噬菌體單克隆,并初步驗(yàn)證其用于建立ZEN的夾心ELISA檢測(cè)法的可行性。
　　結(jié)果:(1) ZEN的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-30.195x+61.622,(R2=0.9849)其中y為抑制率,x為競(jìng)爭(zhēng)物濃度的對(duì)數(shù),檢測(cè)范圍（IC80-IC20)為0.25ng/mL-24.12ng/mL,半抑制率 IC50為2.426ng/mL,檢測(cè)限為0.114ng/mL;(2)ZEN的直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法標(biāo)準(zhǔn)曲

4、線的回歸方程為y=-40.205x+46.303(R2=0.9799),檢測(cè)范圍（IC20-IC80)0.145ng/mL-4.51ng/mL,IC50為0.8ng/mL,檢測(cè)限為0.081ng/mL;(3)通過3輪篩選,隨機(jī)挑取40個(gè)噬菌斑進(jìn)行夾心ELISA鑒定,結(jié)果顯示有2株噬菌體克隆與1G4-ZEN的結(jié)合親和力略高于與1G4的,但進(jìn)行ZEN梯度濃度檢測(cè)未顯示有差別。
　　結(jié)論:1、利用ZEN單抗及其抗獨(dú)特型抗體成功建立了ZE