玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及高通量定性、定量檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為具有雌性激素活性的真菌毒素。ZEN具有很強(qiáng)的生殖毒性、致畸性和免疫抑制毒性等，人或動(dòng)物長(zhǎng)期食用被ZEN污染的食物或飼料，會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害。盡管我國(guó)目前對(duì)飼料、谷物和谷物食品中的ZEN檢測(cè)通常采用高效液相色譜、液-質(zhì)聯(lián)用色譜等方法，但這些方法遠(yuǎn)不能滿足不同樣本中ZEN等真菌毒素的不同檢測(cè)需求。本文通過研制抗ZEN單克隆抗體，進(jìn)而基于免疫層析、免疫傳感、化學(xué)

2、發(fā)光、液相芯片等原理與技術(shù)，建立了多種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快速、靈敏、高通量的免疫學(xué)檢測(cè)方法，為監(jiān)測(cè)谷物、谷物食品、飼料、動(dòng)物源性食品中ZEN及其他真菌毒素的殘留提供技術(shù)支撐。
　　ZEN是一種半抗原，為了制備其完全抗原，首先合成了玉米赤霉烯酮-6-羧甲氧肟，再通過碳二亞胺法與牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，制備出完全抗原BSA-ZEN和OVA-ZEN。以BSA-ZEN為免疫原，免疫BALB/c小鼠后，取免疫小鼠的

3、脾臟與SP2/0細(xì)胞融合。通過3次篩選和亞克隆，最終獲得了4株穩(wěn)定分泌抗ZEN單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。選擇其中效價(jià)最高的2C9細(xì)胞株，建立了檢測(cè)ZEN的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。其檢測(cè)限（IC10，即10％抑制濃度）為0.051 ng/mL。交叉反應(yīng)結(jié)果表明，該抗體對(duì)ZEN結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率為16％，與伏馬毒素B1、嘔吐毒素和黃曲霉毒素B1均無交叉反應(yīng)。
　　為了解決大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)、快速初篩需求，本文基于競(jìng)爭(zhēng)ELISA和免疫層析

4、原理，建立了定性和定量免疫膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)。分別用粒徑25 nm的膠體金標(biāo)記抗ZEN單克隆抗體和抗伏馬毒素B1(FB1)單克隆抗體，制成膠體金標(biāo)記抗體墊，以硝酸纖維素膜為層析介質(zhì)，分別包被ZEN偶聯(lián)抗原(BSA-ZEN)和FB1偶聯(lián)抗原(OVA-FB1)作為檢測(cè)線，包被羊抗鼠二抗作為質(zhì)控線。在對(duì)試紙條制備材料、緩沖液組成和pH、添加物種類和濃度、樣品稀釋度、包被抗原濃度以及金標(biāo)抗體濃度等進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，組裝成試紙條，建立了同時(shí)檢測(cè)

5、谷物中ZEN和FB1的雙重定性和定量膠體金試紙條分析方法。雙重定性試紙條對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品中ZEN和FB1的檢測(cè)限分別為6 ng/mL和50 ng/mL。雙重定量試紙條對(duì)ZEN的檢測(cè)區(qū)間為0.94-7.52 ng/mL，檢測(cè)限為0.35 ng/mL;對(duì)FB1的檢測(cè)區(qū)間為9.34-100.45 ng/mL，檢測(cè)限為5.23 ng/mL。試紙條的檢測(cè)方法不但快速，較此前報(bào)道的方法大幅提升了檢測(cè)靈敏度。
　　為了實(shí)現(xiàn)特定樣品中玉米赤霉烯酮的高靈敏

6、檢測(cè)，利用堿性磷酸酶可以將無色、無電化學(xué)活性的對(duì)硝基苯磷酸轉(zhuǎn)化為黃色、有電化學(xué)活性的對(duì)硝基苯酚的原理，將ELISA與電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，建立定量檢測(cè)分析方法。通過對(duì)反應(yīng)緩沖液種類、pH、電化學(xué)參數(shù)、包被抗原濃度、抗體濃度等的優(yōu)化，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.002 ng/mL，檢測(cè)區(qū)間為0.004-9.5ng/mL。該方法不但拓寬了檢測(cè)區(qū)間，還可實(shí)現(xiàn)高通量、高靈敏、快速檢測(cè)食品等樣本中痕量的真菌毒素。
　　基于化學(xué)發(fā)光和信號(hào)放大系統(tǒng)可提高檢

7、測(cè)體系的靈敏度，本文在ELISA的基礎(chǔ)上，通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)、納米金系統(tǒng)的逐個(gè)加入，建立了三種直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法。通過對(duì)各方法中反應(yīng)試劑濃度、孵育時(shí)間、甲醇濃度等的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)隨著信號(hào)放大系統(tǒng)的加入，檢測(cè)限逐漸提升，基于納米金系統(tǒng)建立的化學(xué)發(fā)光免疫方法檢測(cè)限可至0.008 ng/mL。該方法首次將兩種信號(hào)放大策略同時(shí)使用，并將雙標(biāo)記納米金(double-codified gold nanoparticles)技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)

8、業(yè)和食品檢測(cè)領(lǐng)域，為樣本中痕量分析物的檢測(cè)提供了又一種快速、精準(zhǔn)的技術(shù)。
　　為了高效檢測(cè)谷物中易同時(shí)出現(xiàn)的多種真菌毒素（ZEN、FB1、嘔吐毒素和黃曲霉毒素B1），本文將四種抗真菌毒素單克隆抗體分別包被在不同編碼的聚苯乙烯微球（49、39、37、19號(hào)）表面，并將四種真菌毒素完全抗原分別與生物素偶聯(lián)，最后使用鏈霉親和素-藻紅蛋白作為信號(hào)報(bào)告蛋白，建立了直接競(jìng)爭(zhēng)多重液相芯片檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法對(duì)ZEN、FB1、嘔吐毒素和黃曲

9、霉毒素B1的檢測(cè)限分別為0.51、6.0、4.3和0.56 ng/mL。對(duì)于加標(biāo)樣品的檢測(cè)，回收率達(dá)92.3％-115.5％，與用LC-MS/MS的檢測(cè)結(jié)果具有顯著相關(guān)性，表明該方法具有很好的應(yīng)用前景。
　　本論文利用制備的單克隆抗體，分別建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA法、雙重定性膠體金免疫試紙條檢測(cè)法、雙重定量膠體金免疫試紙條檢測(cè)法、電化學(xué)免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法和液相芯片多重檢測(cè)法，在確保檢測(cè)方法特異的前提下，優(yōu)化了檢測(cè)過程中的核心參數(shù)，