脂肽羧甲基殼聚糖納米穩(wěn)定體系的構(gòu)建及對金葡菌生物被膜及其產(chǎn)毒的控制.pdf

1、羧甲基殼聚糖(CMCS)是一種水溶性好，具有廣譜抑菌活性的陽離子多糖，目前在醫(yī)藥、食品保鮮等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。將其制備成納米級(jí)粒子可以增強(qiáng)其抗菌性能。由于殼聚糖納米粒制備過程中常出現(xiàn)納米化粒子重新團(tuán)聚等問題，影響了使用效果。因此，改進(jìn)殼聚糖納米粒的制備方法，構(gòu)建納米化粒子穩(wěn)定體系，成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)問題。而納豆菌抗菌脂肽(Bacillus natto antimicrobial peptide, BNAP)是一類天然抗菌脂肽，是

2、一種安全無毒的、具有油水兩相的良好的生物表面活性劑，不僅有很好的抗菌活性，且乳化性能優(yōu)良，可作為殼聚糖納米粒穩(wěn)定劑的良好選材。近年來，生物被膜給食品工業(yè)帶來的嚴(yán)重食品安全問題已引起人們的廣泛關(guān)注，尋找高效的控制方法成為科學(xué)工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。由于生物被膜致密的結(jié)構(gòu)，許多抗菌制劑難以迅速滲透進(jìn)入被膜內(nèi)部殺死菌體。而羧甲基殼聚糖制成納米粒后，其粘度降低，粒徑大大減小，將更容易發(fā)揮對生物被膜的控制作用。因此，考察新工藝制備的納米粒對生物被膜的控

3、制作用，對于研究和建立生物被膜控制新方法具有重要意義。
　　本文通過抗菌脂肽乳化分散離子交聯(lián)法制備羧甲基殼聚糖納米粒，用可見光分光光度法測定其溶解性、穩(wěn)定性，烏氏粘度計(jì)測定其粘度變化，掃描電鏡考察其形態(tài)變化，測其乳化力考察其乳化性能，利用紅外光譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，通過抗菌脂肽乳化分散離子交聯(lián)法制備的羧甲基殼聚糖納米粒，具有很好的溶解性，靜置5d內(nèi)也具有很好的穩(wěn)定性，加入BNAP制備的納米粒形態(tài)均一，分散性好，粘度降低，乳

4、化性能增強(qiáng)，由紅外圖譜可知，制成納米粒子后羧甲基殼聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。
　　加入 BNAP制備出的羧甲基殼聚糖納米粒的抑菌和殺菌效果較加之前均有很大改善，且對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用，但抑菌效果存在明顯差異。通過液體稀釋法測定納米粒的最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)，牛津杯雙層營養(yǎng)瓊脂法測定納米粒的抑菌活性，比較 BNAP-CMCS納米粒、CMCS納米粒及二者混合液的抑菌效果，測定了納米粒濃度、體系p

5、H值對BNAP-CMCS納米粒抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，BNAP-CMCS納米粒的MIC值和MBC值最小，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑（27.65±0.64mm）比二者混合液的抑菌圈直徑（25.68±0.48mm）大，對大腸桿菌的抑菌圈直徑（34.26±0.44mm）亦較二者混合液（26.28±0.38mm）大，表明制備成納米粒后，其抑菌性能有顯著改善。BNAP-CMCS納米粒的抑菌活性隨濃度的增加而增強(qiáng)，隨著體系pH的增加抑菌能力減弱

6、，比較其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌的抑菌作用（34.26±0.44 mm）較金黃色葡萄球菌（27.65±0.64mm）強(qiáng)。
　　建立金黃色葡萄球菌生物被膜模型，研究它們在不銹鋼片上的形成及被膜菌的生長情況，結(jié)合游離態(tài)金黃色葡萄球菌評(píng)價(jià) BNAP-CMCS納米粒對生物被膜的形成及被膜菌生長的作用。采用結(jié)晶紫染色染法測定生物被膜的形成情況，超聲波平板計(jì)數(shù)法測定被膜態(tài)金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，被膜態(tài)金黃

7、色葡萄球菌的生長與其生物被膜的形成密切相關(guān)，在亞抑菌濃度條件下，BNAP-CMCS納米粒對生物被膜的形成及被膜菌的生長均具有很好的抑制作用，且其抑制作用隨納米粒濃度的增加逐漸增強(qiáng)。在培養(yǎng)初期加入低濃度納米粒在一定時(shí)期內(nèi)能很好的抑制生物被膜的形成及被膜菌的生長，但隨著游離菌菌體濃度的不斷增加，生物被膜不斷形成。在對數(shù)期內(nèi)加入2MIC的納米粒能很好的抑制生物被膜的形成及被膜菌的生長，并能清除部分未成熟的生物被膜。4MIC的納米粒對生物被膜的

8、清除作用不明顯，但對被膜菌的清除效果顯著（P≤0.05），8MIC的納米粒對生物被膜及被膜菌的清除效果極其顯著（P≤0.01）。
　　結(jié)合游離態(tài)金黃色葡萄球菌的產(chǎn)毒情況分析被膜態(tài)金黃色葡萄球菌的產(chǎn)毒變化規(guī)律，評(píng)價(jià) BNAP-CMCS納米粒對被膜菌產(chǎn)毒的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被膜態(tài)金黃色葡萄球菌的產(chǎn)毒變化規(guī)律與游離菌不同，游離菌產(chǎn)毒量起初不斷增加，后增至相對穩(wěn)定狀態(tài)。與生物被膜的形成過程類似，被膜菌的產(chǎn)毒亦是個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程，產(chǎn)毒量呈現(xiàn)先