殼聚糖對(duì)導(dǎo)管大腸埃希菌生物被膜形成和清除的影響.pdf

1、目的：細(xì)菌在人體內(nèi)外生存的主要形式是生物被膜，與生物被膜相關(guān)的感染在臨床上非常普遍。本研究以導(dǎo)管為載體建立大腸埃希菌生物被膜的體外模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)菌計(jì)數(shù)、生物被膜定量、銀染色和掃描電鏡的觀察，來(lái)研究殼聚糖、甲殼素是否能抑制生物被膜的形成；用細(xì)菌計(jì)數(shù)來(lái)研究殼聚糖、甲殼素是否能清除生物被膜細(xì)菌，并初步探討其作用機(jī)制。 方法： 1.將甲殼素和分子量5000、30萬(wàn)、100萬(wàn)殼聚糖包被在導(dǎo)管上，設(shè)空白導(dǎo)管為第1組，包

2、被分子量5000殼聚糖的導(dǎo)管為第2組，包被分子量30萬(wàn)殼聚糖的導(dǎo)管為第3組，包被分子量100萬(wàn)殼聚糖的導(dǎo)管為第4組，包被甲殼素的導(dǎo)管為第5組。用相同的培養(yǎng)方法分別建立大腸埃希菌生物被膜，7天后對(duì)各組進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)、測(cè)結(jié)晶紫染色的吸光度值、銀染色與掃描電子顯微鏡的觀察以及細(xì)菌的抗生素藥敏測(cè)定。 2.以空白導(dǎo)管為載體建立大腸埃希菌生物被膜模型，7天后將模型分別放入3％的醋酸溶液、1％的甲殼素酸溶液、分子量5000、30萬(wàn)、100萬(wàn)殼聚

3、糖酸溶液中，在36℃孵育。以3％的醋酸溶液為第1組、分子量5000的殼聚糖酸溶液為第2組、分子量30萬(wàn)的殼聚糖酸溶液為第3組、分子量100萬(wàn)的殼聚糖酸溶液為第4組、甲殼素酸溶液為第5組，分別在0h、48h、96h時(shí)對(duì)各組細(xì)菌計(jì)數(shù)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 細(xì)菌計(jì)數(shù)、吸光度值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，抑菌環(huán)直徑以均值表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，設(shè)P＜0.05有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 1對(duì)生物被膜形成的影響

4、1.1實(shí)驗(yàn)1、2、3、4和5組的細(xì)菌計(jì)數(shù)值依次是2.29×107 cfu/ml、1.19×107 cfu/ml、1.45×107cfu/ml、1.99×107cfu/ml和2.15×107cfu/ml。第2、3實(shí)驗(yàn)組分別與第1組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說(shuō)明分子量5000、30萬(wàn)殼聚糖具有在大腸埃希菌生物被膜形成中減少細(xì)菌數(shù)量的作用；第4、5實(shí)驗(yàn)組分別與第1組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說(shuō)明分子量100萬(wàn)殼聚糖和甲

5、殼素不具有在大腸埃希菌生物被膜形成中減少細(xì)菌數(shù)量的作用；第2實(shí)驗(yàn)組和第3實(shí)驗(yàn)組比較，第2實(shí)驗(yàn)組的作用更明顯(P＜0.05)。 1.2實(shí)驗(yàn)1、2、3、4和5組染色后的吸光度值依次是：0.137、0.050、0.080、0.135和0.138。第2、3實(shí)驗(yàn)組分別與第1組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說(shuō)明分子量5000、30萬(wàn)殼聚糖具有使大腸埃希菌生物被膜形成量減少的作用；第4、5實(shí)驗(yàn)組分別與第1組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.0

6、5)，說(shuō)明甲殼素和分子量100萬(wàn)殼聚糖不具有使大腸埃希菌生物被膜形成量減少的作用；第2實(shí)驗(yàn)組和第3實(shí)驗(yàn)組比較，第2實(shí)驗(yàn)組的作用更加明顯(P＜0.05)。 1.3銀染色結(jié)果：實(shí)驗(yàn)1組銀染照片中絮狀的膜樣物為生物被膜。實(shí)驗(yàn)2組、3組的銀染照片可見(jiàn)少量散落的黑點(diǎn)或黑斑，無(wú)黑染的絮狀膜樣物。實(shí)驗(yàn)4組、5組銀染照片，可見(jiàn)較多散落的黑點(diǎn)或黑斑，有黑染的絮狀膜樣物。 1.4掃描電鏡觀察：實(shí)驗(yàn)1組的細(xì)菌分布較均勻、密集，少量細(xì)菌聚集成團(tuán)；進(jìn)一步

7、放大可見(jiàn)細(xì)菌的細(xì)胞壁光滑、菌體規(guī)則、兩端鈍圓，細(xì)菌間有胞外物交聯(lián)。實(shí)驗(yàn)2組、3組菌落分布較少，因?yàn)榘涣藲ぞ厶嵌示奂癄?，膜狀物為殼聚糖；進(jìn)一步放大見(jiàn)菌體有凹陷、切痕、扭曲現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)4組、5組細(xì)菌密集分布，大小不一。 1.5藥敏測(cè)定：包被殼聚糖的實(shí)驗(yàn)2組、3組、4組和包被甲殼素的實(shí)驗(yàn)5組分別與實(shí)驗(yàn)1組比較，對(duì)細(xì)菌耐藥性無(wú)影響。 2.對(duì)生物被膜清除的影響Oh 時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌計(jì)數(shù)值均為：22.9×106cfu/ml。第1、

8、2、3、4和5實(shí)驗(yàn)組48h時(shí)細(xì)菌計(jì)數(shù)值依次是：3.95×106cfu/ml、1.52×106cfu/ml、3.33×106cfu/ml、3.70 X 106cfu/ml和3.80×106cfu/ml；96h時(shí)細(xì)菌計(jì)數(shù)值依次是：2.17×106cfu/ml、1.29×106cfu/ml、1.70×106cfu/ml、1.80×106cfu/ml和1.84×106cfu/ml。 在48h時(shí)，第2組、3組分別與第1組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、差異(P＜0.05)，說(shuō)明分子量5000、30萬(wàn)殼聚糖具有清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用；第4、5實(shí)驗(yàn)組分別與第1組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說(shuō)明甲殼素、分子量100萬(wàn)殼聚糖無(wú)清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用。第2和第3實(shí)驗(yàn)組比較，第2組的清除作用明顯(P＜0.05)。 在96h時(shí)，只有第2組與第1組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說(shuō)明分子量5000殼聚糖仍具有清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用；第3、4、5

10、實(shí)驗(yàn)組與第1組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說(shuō)明甲殼素、分子量30萬(wàn)、100萬(wàn)殼聚糖無(wú)清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用。結(jié)論： 1、分子量5000、30萬(wàn)的殼聚糖對(duì)大腸埃希菌生物被膜的形成有抑制作用，而且分子量5000殼聚糖的抑制作用比30萬(wàn)分子量殼聚糖明顯。 2、48h時(shí)，分子量5000、30萬(wàn)的殼聚糖都有清除大腸埃希菌生物被膜細(xì)菌的作用；96h時(shí)，只有5000分子量殼聚糖具有清除作用。分子量5000殼聚糖的清