殼聚糖納米分散體系構(gòu)建及抑菌性能研究.pdf

1、殼聚糖(CS)是一種具有廣譜抑菌性的陽(yáng)離子多糖。近年來(lái)，對(duì)于CS及其衍生物的抑菌機(jī)理研究已經(jīng)有了長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展，但其確切的抑菌機(jī)理只有一些推論性的報(bào)道。而且在以往對(duì)CS抑菌機(jī)理的研究中，大多是在溶液狀態(tài)下研究CS的抑菌行為。本文構(gòu)建了一種新型的CS納米分散體系，采用界面接觸抑菌的新方法，進(jìn)行CS的抑菌行為和細(xì)菌的生物化學(xué)信息變化的探索研究。 采用酸水解法制備了三種不同分子量(Mw)的殼聚糖，Mw分別為1100 kDa、300 kD

2、a和38 kDa，而且各個(gè)樣品的脫乙酰度基本相同。CS與油酰氯反應(yīng)制備了油酰殼聚糖(OCS)復(fù)合物，紅外光譜中的特征吸收峰表明油?；鶊F(tuán)已經(jīng)成功引入了CS分子中，并計(jì)算得出OCS的取代度(DS)分別為11％、5％和2.5％。采用乳化法由OCS制備的油酰殼聚糖納米球(OCNP)呈球形且形態(tài)完整。粒徑分布表明，納米球大小均一，平均粒徑為275.3nm(樣品C)和327.4nm(樣品B)。OCNP在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中較CS和OCS具有更好的分散性

3、，是一種良好的固相分散體系。 OCNP對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用，但抑菌效果存在明顯差異。測(cè)定了納米球濃度、殼聚糖Mw、油酰殼聚糖DS、體系pH值4個(gè)因素對(duì)OCNP抑菌活性的影響。結(jié)果表明OCNP在以上4個(gè)因素的作用下對(duì)于不同菌種生長(zhǎng)的影響是不同的。殼聚糖納米分散體系對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用隨著體系中納米球濃度的增加而增強(qiáng)。對(duì)于大腸桿菌，五種OCNP的最低抑菌濃度(MIC)從31.25mg/L

4、至125mg/L不等；對(duì)于金黃色葡萄球菌，五種OCNP的MIC均為125mg/L。殼聚糖Mw對(duì)OCNP抑菌活性的影響因菌種而異。在針對(duì)大腸桿菌的抑菌試驗(yàn)中，低分子量(Mw=38 kDa)CS制備的OCNP具有更強(qiáng)的抑菌活性。而在金黃色葡萄球菌的試驗(yàn)中，不同Mw殼聚糖制備的OCNP其MIC相同，抑菌活性沒(méi)有明顯差異。油酰取代度對(duì)納米球抑菌活性的影響也受到不同受試菌的影響。中取代度(DS5％)的OCNP對(duì)大腸桿菌的抑制作用最明顯；不同油酰取

5、代度納米球?qū)瘘S色葡萄球菌的抑制生長(zhǎng)效果一致。在所試的pH范圍(pH4-6)內(nèi)，納米分散體系對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌活性隨體系pH值的升高而增強(qiáng)，pH達(dá)到6時(shí)其抑菌活性最強(qiáng)。殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，納米分散體系能在5 min內(nèi)殺死90％以上的細(xì)菌，與CS的殺菌能力相當(dāng)。 OCNP對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性和超微形態(tài)具有明顯的影響。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌經(jīng)OCNP處理后A260迅速增加，表明在納米球的作用下胞內(nèi)的DNA，RNA等大分子迅速釋放到

6、胞外，細(xì)胞膜的完整性被破壞。而鎂離子的加入使胞內(nèi)物質(zhì)的釋放大幅下降，有效的穩(wěn)定了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，說(shuō)明OCNP對(duì)細(xì)胞壁上鎂離子的螯合作用是其抑菌性能的一部分。針對(duì)革蘭氏陰性菌特殊的細(xì)胞外膜和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，首先采用疏水性熒光探針1-N-苯基-萘胺(NPN)，以NPN在外膜破壞后進(jìn)入胞內(nèi)環(huán)境中時(shí)熒光強(qiáng)度的增加，證明了OCNP對(duì)大腸桿菌外膜結(jié)構(gòu)滲透性的影響；對(duì)細(xì)菌內(nèi)膜滲透性的檢測(cè)以o-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)為底物，胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶在

7、細(xì)菌內(nèi)膜受損后可以釋放至胞外，作用于ONPG后生成鄰硝基苯酚，鄰硝基苯酚含量的顯著升高，證明OCNP使大腸桿菌內(nèi)膜滲透性增加。而細(xì)菌懸液中電導(dǎo)率的升高再次證明了OCNP增大了細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果顯示，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中的蛋白含量減少，分析其原因是OCNP破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致了胞內(nèi)可溶性蛋白的外滲，或是抑制了某些蛋白的合成。培養(yǎng)基中糖含量沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的變化。通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察

8、到了OCNP對(duì)細(xì)菌的抑制作用過(guò)程。結(jié)果證明納米球可以結(jié)合在細(xì)菌表面，通過(guò)界面抑制作用產(chǎn)生抑菌行為，進(jìn)而在細(xì)菌表面形成孔洞或破壞膜功能。直觀的證實(shí)了OCNP與細(xì)菌表面的吸附、結(jié)合是其發(fā)揮抑菌作用的必經(jīng)步驟。 OCNP在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌胞外和胞內(nèi)可能存在多種作用位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)細(xì)菌表面疏水性的分析，隨著OCNP濃度的增高，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的表面疏水性明顯下降。OCNP對(duì)菌體膜蛋白熒光光譜的影響表明，納米球會(huì)導(dǎo)致菌體細(xì)

9、胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改變膜蛋白的空間構(gòu)象。SDS-PAGE顯示OCNP對(duì)大腸桿菌外膜蛋白具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，外膜蛋白有可能是OCNP在大腸桿菌表面的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)卵磷脂對(duì)OCNP抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的研究，揭示了磷脂在OCNP與金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞膜相互作用中是結(jié)合位點(diǎn)，與OCNP表面的自由氨基發(fā)生反應(yīng)，改變菌體細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。在進(jìn)一步考察磷酸基團(tuán)對(duì)OCNP抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響時(shí)，證明了磷脂中的

10、磷酸基團(tuán)是OCNP與金黃色葡萄球菌相互作用時(shí)的結(jié)合位點(diǎn)。熒光顯微鏡觀察的結(jié)果表明異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的FITC-OCS納米球進(jìn)入細(xì)菌的方式因菌種而異。對(duì)于金黃色葡萄球菌，F(xiàn)ITC-OCS納米球能夠在較短的時(shí)間內(nèi)透過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，進(jìn)入菌體內(nèi)部；而對(duì)于大腸桿菌，F(xiàn)ITC-OCS納米球在菌體表面滯留15 min后才能進(jìn)入菌體內(nèi)部。采用凝膠阻滯的方法驗(yàn)證了OCNP在離體條件下與菌體DNA/RNA的直接相互作用，推測(cè)核酸是OCNP在胞