阪崎克羅諾桿菌間毒力比較與致病因子研究.pdf

1、阪崎克羅諾桿菌是一種無芽孢的兼性厭氧革蘭氏陰性菌，它容易寄生于人和動物的腸道內(nèi)?，F(xiàn)有研究已表明嬰幼兒配方奶粉是致嬰幼兒、早產(chǎn)兒敗血癥、腦膜炎以及壞死性結(jié)腸炎的主要感染來源渠道，可導(dǎo)致嬰幼兒高達(dá)40％～80％的死亡率。近年來阪崎克羅諾桿菌已被廣泛關(guān)注，針對其危害的研究也越來越深入。然而，對其致病機(jī)理的探討目前還非常薄弱。因此，針對阪崎克羅諾桿菌的致病機(jī)理的研究將是今后研究的熱點(diǎn)，這對于預(yù)防和治療阪崎克羅諾桿菌的感染具有重要意義。
　

2、　為了進(jìn)一步了解阪崎克羅諾桿菌的致病機(jī)理，本研究利用實驗室已有43株菌株，通過對SD乳鼠進(jìn)行活菌灌胃后、統(tǒng)計血液、腦組織中活菌數(shù)、以及腸組織與剩余尸體比的數(shù)據(jù)，來比較不同菌株的毒性大小。結(jié)果顯示，7、23、36、38、50、52號菌株毒性較高，17、18、22、24、26、27、28、31、32、47、48、49號菌株毒性較低。為了進(jìn)一步獲得毒性因子，本研究結(jié)合Box-PCR分型結(jié)果，挑選出親源關(guān)系關(guān)系較近的36號菌株（高毒菌株）和17

3、號菌株（低毒菌株），通過二維電泳比較其差異蛋白，從中篩選獲得毒性相關(guān)因子。通過比較兩株菌的二維電泳圖譜，共發(fā)現(xiàn)108個差異蛋白點(diǎn)。通過質(zhì)譜鑒定，101個蛋白被成功鑒定。對這些差異蛋白進(jìn)行相似的數(shù)據(jù)分析與資料查閱，共發(fā)現(xiàn)15個可能與毒力相關(guān)的蛋白，他們分別是GroEL，HtpG，DegP, ClpB, OmpW, Flagellin, TerE, TerZ, TerD, TerX, TerA, VirB4, BipA,以及未知功能蛋白ML

4、Br01669和yxxBOS。
　　在前期的研究工作基礎(chǔ)上，選擇了三種未知功能蛋白的基因，它們分別是生物膜相關(guān)基因ESA_02170、表面蛋白相關(guān)基因ESA_02516、以及文獻(xiàn)報道的毒力相關(guān)基因ESA_02736，通過基因敲除研究其毒力相關(guān)性。根據(jù)基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增出含有酶切位點(diǎn)的上下游片段及氯霉素抗性片段，并利用重組DNA技術(shù)將三部分連接至pMD18-T，成功構(gòu)建出高特異性的長片段敲除載體。其中，ESA_02170基因的上

5、游片段為672 bp、下游片段為615 bp，敲除片段全長為2283 bp; ESA_02516基因基因的上游片段為791 bp、下游片段為632 bp，敲除片段全長為3508 bp;ESA_02736基因的上游片段為661 bp、下游片段為652 bp，敲除片段全長為2117 bp。將含有重組酶基因的敲除載體pKD46電轉(zhuǎn)化至ATCC BAA-894號菌株中，制備了能夠表達(dá)重組酶的宿主菌株。將敲除片段轉(zhuǎn)入含有pKD46的宿主菌中，通過