PCR技術檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的研究.pdf

1、阪崎腸桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、菌血癥、小腸結腸炎，并可能引起神經功能紊亂，造成嚴重的后遺癥，死亡率高達20％～50％以上，引起世界范圍內的廣泛關注。通過研究發(fā)現嬰兒配方奶粉是其主要的感染源。傳統(tǒng)方法操作繁瑣，檢測時間長，且靈敏度較低。本研究利用FTA濾膜與PCR技術相結合的方法建立了一套從嬰兒配方奶粉中快速檢出阪崎腸桿菌的方法，縮短了阪崎腸桿菌的檢測時間，提高了靈敏度。 本研究以阪崎腸桿菌的16S rRNA基因為靶基因，選

2、擇特異性引物，進行PCR擴增，檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌。對PCR反應體系中鎂離子濃度、引物添加量及退火溫度和循環(huán)數進行優(yōu)化，以確定適宜的PCR反應體系和擴增程序，其適宜反應體系為:6μL10×PCR buffer，4μL dNTPs混合物，2.5Mg2+μL(25mM)，2μL10 μmol正向引物，2μL 10μmol反向引物，0.25μL(5U/μL)Taq，23.25μL水，總反應體系為50μL；其適宜的PCR擴增程序為:PC

3、R反應采用冷啟動，95℃預變性5 min；變性95℃1min～退火61℃0.5min進行35個循環(huán)。PCR反應產物在2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。對擴增產物進行了測序，PCR擴增產物序列與文獻報道的靶基因序列的同源性達100％，從而證實PCR擴增產物確為目的擴增產物。本研究共檢測了16株菌，以驗證引物的特異性，結果表明:4株阪崎腸桿菌均為陽性結果；12株其它菌株均為陰性結果。因此該引物特異性強，可用于檢測阪崎腸桿菌。

4、 采用FTA濾膜制備模板進行PCR擴增，其方法的靈敏度為7×101 cfu/mL。 采用FTA濾膜制備模板，利用PCR技術檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌，以確定檢出限。結果表明，經過4h增菌后嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢出限為7×100cfu/100g?？稍?h內完成對嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測，比目前普遍采用的傳統(tǒng)檢測的方法縮短了12～22h。 比較了檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的6種模板制備方法，結果表明F

5、TA濾膜法可高效從樣品中提取阪崎腸桿菌DNA，可有效的消除PCR反應的抑制因子，靈敏度高、操作簡便、耗時短，該方法明顯優(yōu)于其他方法。 對實際樣品進行檢測，將本方法與行業(yè)標準SN/T 1632.1-2005方法進行比較，確定本方法敏感性為100％，特異性為98.2％符合率為98.2％。 本研究方法使用FTA濾膜法制備模板DNA，可高效的提取樣品中的DNA，有效的消除PCR反應抑制因子，操作簡便，為PCR快速檢測食品中的致病