內(nèi)毒素休克小鼠肝臟血管特異性結(jié)合肽的體內(nèi)篩選及鑒定.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是由各種致病微生物或其毒素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是嚴(yán)重感染、重度創(chuàng)傷和燒傷、大手術(shù)和休克等臨床危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克(septic shock)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)和多器官功能障礙綜合征(multiple

2、organ dysfunction syndrome，MODS)等。
　　 膿毒癥及其并發(fā)癥是危重病醫(yī)學(xué)面臨的棘手問題，一直是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)患者高發(fā)病率和高死亡率的主要原因，其中SIRS死亡率接近26％，膿毒癥休克的死亡率更可高達(dá)82％。當(dāng)前，膿毒癥存在著患病率高、病死率高、治療費(fèi)用高的三高現(xiàn)象，已經(jīng)構(gòu)成對人類健康的嚴(yán)重威脅和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的巨大負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，膿毒癥的患病率約為總?cè)丝?/p>

3、的0.3％，我國每年發(fā)生的總病例數(shù)超過400萬例，并以每年約1.5％的比例增長，病死率平均為40％；美國每年約有75萬人發(fā)生膿毒癥休克，病死率可達(dá)50％以上。
　　 近年來，膿毒癥及發(fā)病機(jī)制的研究已成為十分活躍的前沿領(lǐng)域之一，日益受到國內(nèi)、外廣大臨床醫(yī)生和科研人員的高度關(guān)注。目前，在膿毒癥發(fā)病機(jī)制與臨床意義的研究上都取得了一定進(jìn)展，但膿毒癥、MODS治療的Ⅲ期臨床試驗并未能取得預(yù)期的效果。盡管付出了巨大的努力，但由于膿毒癥發(fā)病機(jī)

4、制復(fù)雜，臨床治療困難，近40年來，其臨床療效和預(yù)后一直沒有得到實(shí)質(zhì)性地改善，已經(jīng)構(gòu)成對人類健康的嚴(yán)重威脅和經(jīng)濟(jì)社會的巨大負(fù)擔(dān)。在生命科學(xué)得到巨大發(fā)展的今天，膿毒癥仍然如此猖獗，無疑引起我們的高度重視。這些事實(shí)表明膿毒癥的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機(jī)制尚有待深入研究，新的干預(yù)途徑更值得探索。
　　 流行病學(xué)分析顯示，在細(xì)菌感染所致的膿毒癥中，有45～60％為革蘭陰性菌感染。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的結(jié)構(gòu)成分之一，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(l

5、ipopolysaccharide，LPS)，是引起膿毒癥的主要因素。LPS進(jìn)入血液循環(huán)后，可刺激單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等主要的炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，并導(dǎo)致相應(yīng)的合成和分泌功能發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞表面一些與炎癥相關(guān)的分子表達(dá)增高或暴露其相應(yīng)的活性結(jié)構(gòu)部位。與正常的細(xì)胞相比，受刺激的細(xì)胞表面存在著數(shù)量和/或結(jié)構(gòu)上具有差異的分子，這些分子可能與內(nèi)毒素休克的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為內(nèi)毒素休克治療新的候選靶點(diǎn)。這些細(xì)胞表面差異分子有

6、可能是炎癥級聯(lián)反應(yīng)時某些重要炎癥介質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，尋找其特異性結(jié)合肽，則有可能通過競爭性抑制相應(yīng)炎癥介質(zhì)與效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)而中和或阻斷這些炎癥介質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)，如進(jìn)一步激活靶細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、介導(dǎo)細(xì)胞黏附等，從而達(dá)到阻斷或減輕全身性炎癥反應(yīng)發(fā)生的目的。這種對特定細(xì)胞具有靶向治療作用的生物活性肽的特點(diǎn)是更為高效和副作用小。其關(guān)鍵步驟為發(fā)現(xiàn)LPS刺激單核巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的特異性高親和力結(jié)合肽。
　　 噬菌體展示技術(shù)是20世紀(jì)90年

7、代發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)，其原理是將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白將展示在噬菌體的表面，而編碼這個融合子的DNA則位于該噬菌體內(nèi)。噬菌體展示技術(shù)的一個最基本的特征是將表現(xiàn)型和基因型有效聯(lián)系起來，即噬菌體表面的特定表現(xiàn)型與噬菌體顆粒中的基因型信息相對應(yīng)，如需得到某個特定的表現(xiàn)型，只需在噬菌體基因組中插入該表現(xiàn)型的相關(guān)基因即可。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子(抗

8、體、酶、細(xì)胞表面受體等)的多肽配體通過一種被稱為淘選(panning)的體外選擇程序得以快速鑒定。最簡單的淘選程序，是將噬菌體展示肽庫與包被有靶分子的平板(或磁珠)共溫育，先洗去未結(jié)合的噬菌體，然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。將被洗脫的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，然后再進(jìn)行下一輪的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)，以富集那些可結(jié)合序列。經(jīng)3～4輪淘選后，通過DNA測序?qū)γ總€可結(jié)合克隆進(jìn)行定性。展示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫可應(yīng)用于許多方面的研究，包括繪制抗原表位圖譜、研究蛋

9、白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和鑒定非肽配體的肽模擬物等。
　　 Ph.D.-C7C噬菌體展示肽庫是將隨機(jī)七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pⅢ)上而構(gòu)建成的一個組合文庫。所展示的隨機(jī)多肽兩側(cè)各有一個半胱氨酸(Cys)。在非還原條件下，這兩個半胱氨酸自發(fā)地形成一個二硫鍵，使展示的多肽環(huán)化。受限于二硫鍵環(huán)內(nèi)的7肽庫已被證實(shí)能識別抗原表位結(jié)構(gòu)、D-氨基酸靶分子的鏡像配基及開發(fā)以多肽為基礎(chǔ)的治療藥物等。
　　 近年發(fā)展起來的體內(nèi)噬菌體

10、展示技術(shù)，是尋找組織、器官特異性結(jié)合多肽的有效手段。此方法可在受體分子尚不清楚的情況下，以受體天然存在的環(huán)境--組織器官為配基，利用噬菌體短肽的抗原特異性，尋找未知的靶分子，確定其結(jié)構(gòu)域。本研究采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，對內(nèi)毒素休克小鼠肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了篩選，尋找其表面分子的特異性結(jié)合肽，以期為內(nèi)毒素休克的治療及其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供新的思路與線索。
　　 我們選取4只BALB/c小鼠，雄性，8周齡，以35 mg/kg的劑量

11、腹腔注射LPS，頸動脈插管后，監(jiān)測小鼠動脈血壓，復(fù)制內(nèi)毒素休克模型。我們對內(nèi)毒素休克狀態(tài)下小鼠的肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了四輪篩選，然后又用正常小鼠做了一次差減篩選，即得到了與休克小鼠肝臟血管特異性結(jié)合，而與正常小鼠肝血管不結(jié)合的噬菌體文庫。我們對所篩得的噬菌體克隆進(jìn)行了一個初步的體內(nèi)回輸實(shí)驗，驗證其在內(nèi)毒素休克小鼠體內(nèi)的靶向情況，一共驗證了20個噬菌體克隆，發(fā)現(xiàn)有15個克隆為陽性克隆(單位重量肝臟中回輸?shù)降氖删w是對照器官的三倍以上)。隨

12、機(jī)挑取噬菌體克隆，經(jīng)過PCR擴(kuò)增出其目的片段以后，進(jìn)行DNA測序，并根據(jù)插入序列推導(dǎo)出外源七肽的氨基酸序列，一共得到正確的有插入片段的序列1，063條。
　　 這些七肽序列中包含大量的三肽殘基，其中一些三肽基序作為生化識別單元(biochemical recognition units)中的配基，往往是某些功能蛋白的模擬表位(mimotooe)，因此尋找這些模擬表位及其對應(yīng)的功能蛋白具有重大意義。我們采用完全重排七肽的方法，應(yīng)用

13、混排(洗牌)算法(shuffling algorithm)，統(tǒng)計大量噬菌體展示七肽中某特定三肽出現(xiàn)的次數(shù)(豐度)及其顯著性，結(jié)果顯示，1，063個陽性噬菌體展示七肽中包括有3，390個不同的三肽殘基，其中豐度具有顯著性意義的三肽有200個。然后，利用Clustal W軟件對包含豐度具有顯著性或豐度較高的三肽基序的七肽進(jìn)行多序列比對(multiple sequence alignment)分析，并結(jié)合氨基酸的性質(zhì)，在這些七肽中尋找特征性短

14、肽基序(模擬表位)，共得到62個特征性短肽基序；通過在線BLAST服務(wù)，將這些短肽基序同鼠蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(SWISS-PROT)進(jìn)行相似性比對分析，獲得所有已知的包含這些特征性短肽的鼠類蛋白；進(jìn)一步應(yīng)用SignalP和TMHMM預(yù)測軟件篩選其中的分泌蛋白和跨膜蛋白，從中獲得目的功能蛋白。
　　 我們對出現(xiàn)次數(shù)最多的噬菌體展示七肽(LTTWAPA)進(jìn)行了體內(nèi)導(dǎo)向效果鑒定和免疫組化染色分析。體內(nèi)導(dǎo)向效果鑒定實(shí)驗顯示，呈現(xiàn)LTTWA

15、PA的噬菌體在休克小鼠單位重量肝臟中的回收量是8.0×108/g，分別是腎臟的40倍(2.0×107/g)，腦組織的80倍(1.0×107/g)。而在正常小鼠的驗證中，目標(biāo)噬菌體在單位重量肝臟中的回收量與腦組織和腎臟沒有明顯差異，均遠(yuǎn)低于在休克小鼠肝臟中的回收量。對照組的空噬菌體在休克小鼠各臟器的的回收量是基本保持一致的。初步認(rèn)為，我們篩選到的該噬菌體克隆在內(nèi)毒素休克小鼠肝臟有很好的導(dǎo)向效果。
　　 免疫組化染色顯示，表達(dá)LTT

16、WAPA序列的噬菌體定位于內(nèi)毒素休克小鼠肝臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在休克小鼠的腦組織和腎臟以及正常小鼠的肝、腎、腦均未見明顯染色。同時，我們設(shè)立了同等量的空噬菌體作為對照，對照組的空噬菌體在休克小鼠和正常小鼠的肝臟均未見染色。說明我們篩選到的該噬菌體能夠有效地靶向于內(nèi)毒素休克小鼠的肝臟血管，而不結(jié)合于休克小鼠的其它臟器，也不結(jié)合于正常小鼠的各臟器。
　　 總之，本研究在靶分子未知的情況下，采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，對內(nèi)毒素休克小鼠肝臟

17、血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行4輪篩選，并與正常小鼠做了一次差減篩選，獲得與內(nèi)毒素休克小鼠肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽序列，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對這些短肽序列進(jìn)行分析和預(yù)測，并進(jìn)一步鑒定預(yù)測得到的功能蛋白和表位模擬肽的生物學(xué)活性。通過以上研究，我們得出以下幾點(diǎn)結(jié)論：
　　 1.成功復(fù)制了內(nèi)毒素休克小鼠模型；
　　 2.運(yùn)用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，篩選到了內(nèi)毒素休克小鼠肝臟血管特異性結(jié)合肽庫。并且經(jīng)過四輪篩選，噬菌體文庫在內(nèi)毒素休克小鼠肝

18、臟得到了有效富集；
　　 3.隨機(jī)挑取20個噬菌體克隆進(jìn)行了體內(nèi)回輸實(shí)驗驗證，有15個克隆為陽性噬菌體克??；
　　 4.通過挑斑和PCR擴(kuò)增，得到了1，063條七肽序列，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)1，063條展示七肽中共包括有3，390個不同的三肽殘基，其中具有顯著性意義的三肽有200個；
　　 5.應(yīng)用Clustal W軟件并結(jié)合氨基酸性質(zhì)，分別對包含具有顯著性意義三肽基序的所有七肽進(jìn)行多序列比對分析，獲得了62

19、個具有表位模擬肽性質(zhì)和功能的特征性短肽；
　　 6.應(yīng)用BLASTP程序與鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析得到包含以上特征性短肽基序的蛋白2，922個，進(jìn)一步利用SignalP和TMHMM預(yù)測軟件獲得分泌蛋白和跨膜蛋白，其中分泌蛋白98條，跨膜蛋白226條，既為分泌蛋白又為跨膜蛋白的序列20條；
　　 7.對出現(xiàn)次數(shù)最多的噬菌體克隆(LTTWAPA)進(jìn)行了體內(nèi)回輸實(shí)驗驗證，體內(nèi)回輸實(shí)驗初步證實(shí)該噬菌體克隆能有效靶向于內(nèi)毒