血管平滑肌特異性SCAP轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及表型鑒定.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一類主要由脂質(zhì)代謝紊亂引起的心血管疾病。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的裂解蛋白（ SREBPs cleavage activating protein，SCAP），與SREBPs形成復(fù)合物進行轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)LDLr和HMGCoAR的轉(zhuǎn)錄，并參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。本實驗通過構(gòu)建血管平滑肌特異性 SCAP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠來研究血管過表達(dá)SCAP對血管斑塊形成和細(xì)胞膽固醇代謝的影響。
　

2、　方法：構(gòu)建含平滑肌特異蛋白SM22啟動子與SCAP443位點突變體真核表達(dá)質(zhì)粒SCAP(D443N)，采用原核微注射將質(zhì)粒注射到卵泡內(nèi)制備目標(biāo)小鼠，獲得編號為1-8的八只FOUNDER小鼠。運用PCR鑒定出SCAP轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。得到的轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和C57小鼠進行交配繁殖子代，通過PCR鑒定初篩，挑選出轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，陽性小鼠保留繼續(xù)與C57小鼠交配五代純化背景。從1、2、5、6、7組(3、4及8號 FOUNDER小鼠死亡)中各挑選

3、出 PCR初篩為陽性小鼠進行Southern blot鑒定進一步驗證外源性的完整整合，選出SCAP表達(dá)明顯的組別進行下一步試驗。免疫組化鑒定小鼠主動脈根部 SCAP、SREBP2、LDLr以及 HMGCoAR的表達(dá)， RT-PCR檢測小鼠主動脈SCAP調(diào)控的相關(guān)基因SREBP2、LDLr以及HMGCoAR等的表達(dá)。表達(dá)最強的組中選出6-8周齡雄性 SCAPTg/+（轉(zhuǎn)基因陽性）及 SCAP+/+（轉(zhuǎn)基因陰性）小鼠各12只，給予高膽固醇飲

4、食喂養(yǎng)48周。油紅O染色查看小鼠主動脈脂質(zhì)聚集以及測量斑塊大小。
　　結(jié)果：將質(zhì)粒pGL3-SM22-SCAP的片段，通過原核微注射獲的了8只 FOUNDER小鼠；免疫組化觀察到 SCAP、SREBP2、LDLr以及HMGCoAR在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的血管表達(dá)較明顯；轉(zhuǎn)基因陽性小鼠主動脈RT-PCR測得靶基因SREBP2、LDLr以及HMGCoAR的表達(dá)水平較對照組明顯增加。FOUNDER小鼠分別和C57小鼠進行交配繁殖至少5代后，篩