全氟辛烷磺酸致小鼠胚胎干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞線粒體損傷及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane Sulfonate，PFOS)是全氟有機(jī)化合物家族中的代表性化合物之一，在環(huán)境中無所不在，在野生動(dòng)物和人類體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有PFOS前體物和鹽類物。該化合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在人體內(nèi)的半衰期長，不易被代謝，可引起各類組織毒性，直接關(guān)系到人類健康問題。近年來國內(nèi)外關(guān)于PFOS毒性研究主要集中在PFOS對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類可能造成的發(fā)育毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性、心血管毒性、免疫毒性和致癌性等。由于PFOS在肝

2、臟中含量最多，故目前關(guān)于PFOS引起的肝臟毒性研究較為深入，且多篇研究報(bào)道已闡明PFOS致肝臟毒性作用機(jī)制主要與激活PPARα受體相關(guān)。而PFOS在心臟的生物累積含量僅次于肝臟，心臟又是胚胎發(fā)育最早形成的器官，已有報(bào)道在胚胎早期暴露烷基磺酸類毒性化合物極易致心臟發(fā)育損傷甚至畸形，如斑馬魚與PFOS共孵育后可引起靜脈竇和動(dòng)脈球的距離增加、心率改變、孵化率下降等現(xiàn)象。雖然研究者掌握了一些關(guān)于PFOS在心臟發(fā)育領(lǐng)域毒性研究資料，但仍處于初始階

3、段，其引起的心臟毒性作用機(jī)制和敏感指標(biāo)尚未完全闡明，因此，亟待深入探索PFOS致心臟發(fā)育毒性作用機(jī)制。
　　小鼠胚胎干(embryonic stem，ES)細(xì)胞自首次從小鼠胚囊內(nèi)層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)后，因其在體外具有分化全能性及自我更新等特點(diǎn)而在各種研究中得到廣泛應(yīng)用。小鼠ES細(xì)胞定向分化成的心肌細(xì)胞不但具備心肌細(xì)胞表型，表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物，也具有心肌細(xì)胞正常的收縮-偶聯(lián)功能，基本模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞分化的過程，該模型已用于化合物致胚胎毒性

4、評(píng)價(jià)和研究。本課題組前期利用SILAC標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了PFOS致小鼠ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化毒性差異蛋白表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFOS處理組和DMSO對(duì)照組比較共有176個(gè)差異蛋白。有28.8％差異蛋白參與了給生物體提供能量和物質(zhì)的代謝過程，包括糖類代謝(4.5％)、核酸代謝(18.7％)、脂質(zhì)代謝(5.6％)等。通過細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白定位在線粒體占11.4％，僅次于細(xì)胞核，推測PFOS致心肌細(xì)胞分化發(fā)育毒性作用的主要原因

5、之一與線粒體功能損傷相關(guān)。
　　線粒體是細(xì)胞合成ATP的重要場所，產(chǎn)生的能量用以維持細(xì)胞正常生理功能，參與胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)和代謝等多種細(xì)胞活動(dòng)。與其他類型細(xì)胞相比，心肌細(xì)胞對(duì)能量需求更高，線粒體更豐富，用以維持其正常新陳代謝及收縮活動(dòng)，因此，心肌細(xì)胞對(duì)外源性化合物導(dǎo)致的線粒體損傷極其敏感。而線粒體依賴性能量通路不僅是啟動(dòng)心肌分化的關(guān)鍵調(diào)控者，也是心肌再生作用的重要靶點(diǎn)，促進(jìn)該環(huán)節(jié)可誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，而抑制該環(huán)節(jié)則可導(dǎo)

6、致心肌分化受阻。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在相互偶聯(lián)，這種結(jié)構(gòu)被命名為線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)(Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)，該結(jié)構(gòu)中起連接作用的主要是線粒體融合蛋白Mfn2和分子伴侶Grp75，其中Mfn2主要通過與Mfn1或Mfn2形成二聚體，而Grp75連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+釋放通道1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3 Receptor，IP3R)和位

7、于線粒體外膜的孔蛋白VDAC偶聯(lián)形成連接復(fù)合物，在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間構(gòu)成連接，以保證Ca2+信號(hào)及脂質(zhì)在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的傳遞，線粒體Ca2+主要影響呼吸鏈中幾種脫氫酶，一定濃度可促進(jìn)ATP合成。此外線粒體損傷時(shí)，線粒體融合蛋白Mfn2表達(dá)減少，導(dǎo)致線粒體膜電位降低。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mammalian target of rapamycin complex2，mTORC2)是由雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Rictor、

8、mLST8、PRR5和mSin1組成，近年研究發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物存在于線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)中，其中Rictor是mTORC2特異性成分，是其發(fā)揮生物學(xué)作用必不可少的部分，Rictor可最大化激活p-Akt(ser473)并對(duì)Akt下游信號(hào)傳導(dǎo)起關(guān)鍵作用。研究表明在Rictor敲除的MEF細(xì)胞中IP3R磷酸化明顯減少，IP3R存在Akt結(jié)合位點(diǎn)，且mTORC2-Akt通過結(jié)合IP3R抑制肌漿網(wǎng)Ca2+釋放至線粒體。mTORC2缺失會(huì)破壞線粒體-

9、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)，造成線粒體缺陷。ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞過程中，伴隨著線粒體結(jié)構(gòu)和功能逐漸成熟，存在能量轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)為無氧糖酵解代謝向高效的線粒體有氧代謝轉(zhuǎn)換，以保證心肌細(xì)胞分化及心肌細(xì)胞正常興奮-收縮偶聯(lián)特征。若心肌細(xì)胞線粒體能量代謝發(fā)生障礙，如線粒體脂肪酸氧化能力降低，可造成脂肪酸堆積，乳酸產(chǎn)量增加，ATP產(chǎn)量減少，進(jìn)而導(dǎo)致興奮收縮功能及Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能等降低，最終誘發(fā)心力衰竭等心臟疾病。已有研究報(bào)道PFOS可導(dǎo)致成年大鼠線粒體損傷

10、，主要與其下調(diào)線粒體內(nèi)ATP合酶表達(dá)相關(guān)，但迄今為止尚未見利用ES細(xì)胞體外定向心肌細(xì)胞分化模型，闡明PFOS致心肌細(xì)胞分化發(fā)育時(shí)線粒體損傷機(jī)制與線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)中若干分子事件的相關(guān)性。
　　表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是表皮生長因子受體家族之一，主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，EGFR信號(hào)通路在胚胎發(fā)育期起著重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)前SD大鼠暴露PFOS引起新生斷

11、奶SD鼠心臟功能損傷與EGFR表達(dá)上調(diào)相關(guān)，EGFR與配體結(jié)合會(huì)促進(jìn)EGFR酪氨酸的自磷酸化，而p-EGFR(Tyr1086)可激活Rictor/mTORC2活性，引起級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)。Rictor/mTORC2通過激活A(yù)kt(Ser473)磷酸化，一方面可促進(jìn)HK2結(jié)合到線粒體外膜上，從而促進(jìn)糖酵解通路，乳酸產(chǎn)量增多，降低線粒體膜電位，另一方面通過增加SREBP1裂解，進(jìn)而增加脂肪酸合成關(guān)鍵酶Acaca和FASN的表達(dá)，最終造成細(xì)胞內(nèi)脂肪

12、酸堆積，進(jìn)一步損傷線粒體。關(guān)于PFOS是否通過增加p-EGFR激活Rictor/mTORC2信號(hào)，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間Ca2+穿梭，改變能量代謝，從而造成線粒體損失的研究尚未報(bào)道。
　　因此，本研究主要基于PFOS致小鼠ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化毒性作用差異蛋白表達(dá)譜結(jié)果，進(jìn)一步探索PFOS對(duì)心肌細(xì)胞分化發(fā)育中線粒體損傷作用及相關(guān)機(jī)制，旨在闡明PFOS是否通過影響線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)中相關(guān)分子事件，干預(yù)Ca2+穿梭運(yùn)動(dòng)和線

13、粒體能量代謝過程，深入揭示PFOS對(duì)機(jī)體重要組織的毒性作用敏感靶點(diǎn)，同時(shí)有利于將EST作為一種有效的毒性靶點(diǎn)評(píng)價(jià)體系在化合物成藥性或環(huán)境毒物對(duì)心臟毒性預(yù)測性評(píng)估中的推廣應(yīng)用，提供較高科學(xué)價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　探索PFOS對(duì)小鼠ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化發(fā)育中線粒體損傷作用及相關(guān)機(jī)制，為深入揭示PFOS對(duì)機(jī)體重要組織的毒性作用敏感靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　采用經(jīng)典的“懸滴培養(yǎng)-懸浮培養(yǎng)-貼壁

14、培養(yǎng)”三步法建立小鼠ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化模型，檢測PFOS對(duì)小鼠ES細(xì)胞定向分化為搏動(dòng)心肌細(xì)胞團(tuán)分化率的影響，并運(yùn)用免疫印跡技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色法檢測心肌細(xì)胞定向分化過程中ES細(xì)胞全能性標(biāo)志蛋白Oct4、中胚層特異性標(biāo)記蛋白brachyury、心肌細(xì)胞特異性蛋白水平α-Actinin和肌球蛋白重鏈MYH10、Ca2+通道相關(guān)蛋白（L-typeCa2+ channel、RyR2）表達(dá)，心肌細(xì)胞數(shù)量及心肌肌小節(jié)成熟結(jié)構(gòu)的形成情

15、況。采用活細(xì)胞工作站測定分化來的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+瞬變、線粒體Ca2+瞬變及胞內(nèi)Ca2+濃度。采用ATP試劑盒檢測PFOS作用后的小鼠ES衍生心肌細(xì)胞(Embryonicstem cell-derived cardiomyocytes，ESC-CMs) ATP產(chǎn)量。JC-1染色考察PFOS作用對(duì)ESC-CMs線粒體膜電位的影響，并采用電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)。利用免疫印跡技術(shù)法檢測PFOS對(duì)凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax/Bcl-2比值的影響。檢測P

16、FOS作用后ESC-CMs的乳酸產(chǎn)量，及采用薄層色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量。利用免疫印跡技術(shù)法檢測PFOS對(duì)線粒體功能相關(guān)蛋白PGC-1α、Mfn1及Mfn2，同時(shí)采用免疫共沉淀檢測PFOS作用后對(duì)MAM結(jié)構(gòu)中IP3R-Grp75-VDAC復(fù)合體及IP3R-Akt結(jié)合的影響，利用免疫印跡技術(shù)法檢測PFOS對(duì)Rictor及其上游p-EGFR(Tyr1086)和其下游效應(yīng)器Akt(Ser473)磷酸化表達(dá)影響，同時(shí)檢測了mTORC2信號(hào)通

17、路中參與線粒體損傷的相關(guān)蛋白HK2、SREBP-1裂解態(tài)，F(xiàn)ASN和Acaca的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.40μM PFOS作用小鼠ES細(xì)胞后，抑制其定向心肌細(xì)胞分化，在分化day5+3、day5+4和day5+5時(shí)，心肌細(xì)胞分化率分別為18±7％、29±6％和42±5％，較DMSO溶劑對(duì)照組均顯著性降低（44±10％、60±3％和79±3％）。PFOS使ES細(xì)胞全能性標(biāo)志蛋白Oct4表達(dá)在分化過程中下降受阻，同時(shí)

18、中胚層特異性標(biāo)記蛋白brachyury、肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白α-Actinin和肌球蛋白重鏈MYH10的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著性下降。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，PFOS作用后降低α-Actinin陽性表達(dá)的心肌細(xì)胞數(shù)。免疫熒光結(jié)果顯示，PFOS組分化而來的心肌細(xì)胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。提示PFOS可抑制小鼠ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化，使分化的心肌細(xì)胞數(shù)量減少、心肌特異性蛋白表達(dá)下降及心肌細(xì)胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。PFOS顯著降低ESC-CMs內(nèi)咖啡因刺激后Ca2+瞬

19、變幅度及胞內(nèi)[Ca2+]i，Western-blot結(jié)果顯示，PFOS組L-型Ca2+通道蛋白表達(dá)明顯降低，而RyR2蛋白表達(dá)水平無明顯差異，提示PFOS可能通過調(diào)節(jié)L-型Ca2+通道蛋白抑制心肌分化，改變RyR受體活性從而降低咖啡因介導(dǎo)的Ca2+瞬變。
　　2.PFOS作用后ESC-CMs的ATP產(chǎn)量顯著降低，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低，電鏡結(jié)果顯示PFOS組小鼠ES細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)嵴腫脹，甚至形成空泡，內(nèi)嵴難以觀察，完整的

20、MAM結(jié)構(gòu)減少，而對(duì)照組線粒體內(nèi)嵴光滑、排列整齊，MAM結(jié)構(gòu)完整。此外，免疫熒光結(jié)果也顯示PFOS組線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重疊較對(duì)照組減少。Western blot結(jié)果顯示，PFOS作用后，兩組的凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax/Bcl-2比值及線粒體細(xì)胞色素C的含量均無明顯差異。乳酸產(chǎn)量檢測結(jié)果顯示，在day5、day5+5的擬胚體(Embryoid bodies，EBs)和ESC-CMs，PFOS組乳酸產(chǎn)量分別是0.46±0.12、0.33±0.02和

21、0.17±0.04 mmol/gprot，較溶劑對(duì)照組0.15±0.03、0.14±0.03和0.10±0.02mmol/gprot均顯著增加。薄層色譜法檢測PFOS作用后細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量也顯著上升。提示PFOS導(dǎo)致ESC-CMs的線粒體膜電位降低，線粒體內(nèi)嵴腫脹，甚至空泡形成，MAM結(jié)構(gòu)破壞，乳酸產(chǎn)量增加，造成脂肪酸堆積，ATP產(chǎn)量降低，但細(xì)胞色素C無溢出，且不引起細(xì)胞凋亡。
　　3.PFOS作用后顯著降低MAM結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵蛋白

22、Mfn2的表達(dá)，而Mfn1蛋白表達(dá)無明顯影響，IP3R-Grp75-VDAC復(fù)合體顯著減少，IP3R和Akt的結(jié)合顯著增加，同時(shí)PFOS顯著降低ESC-CMs內(nèi)ATP刺激后線粒體Ca2+瞬變幅度，提示PFOS減少Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體釋放可能與MAM結(jié)構(gòu)破壞及Akt和IP3R結(jié)合增加相關(guān)。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFOS增加了p-EGFR（Tyr1086）、Rictor及其下游效應(yīng)器p-Akt(Ser473)蛋白的表達(dá)，且

23、PFOS組HK2在線粒體內(nèi)的表達(dá)顯著高于溶劑對(duì)照組。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果顯示PFOS作用后HK2與線粒體染料Mito的共表達(dá)與溶劑對(duì)照組相比明顯增加。PFOS組LDHA、裂解態(tài)SREBP-1，F(xiàn)ASN和Acaca表達(dá)顯著高于溶劑對(duì)照組，提示PFOS通過與EGFR作用，激活Rictor介導(dǎo)HK2結(jié)合至線粒體膜上，從而促進(jìn)糖酵解通路。同時(shí)，Rictor通過促進(jìn)SREBP-1裂解，進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成，造成細(xì)胞內(nèi)脂肪酸堆積;另一方面Rict

24、or信號(hào)分子促進(jìn)SREBP-1裂解導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂肪酸堆積，抑制PGC-1α表達(dá)，進(jìn)而破壞MAM結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵蛋白Mfn2表達(dá)，同時(shí)增加Akt與IP3R受體結(jié)合，減少M(fèi)AM結(jié)構(gòu)中IP3R-Grp75-VDAC復(fù)合體形成，導(dǎo)致線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穿梭減少。
　　結(jié)論:
　　1.PFOS致ESC-CMs線粒體膜電位降低，ATP產(chǎn)量降低，線粒體內(nèi)嵴腫脹，甚至空泡形成，MAM結(jié)構(gòu)破壞，乳酸產(chǎn)量增加，造成脂肪酸堆積，但細(xì)胞色素C無溢出，且不引

25、起細(xì)胞凋亡。同時(shí)，PFOS顯著降低ESC-CMs內(nèi)Ca2+濃度，降低RyRs受體介導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+瞬變。
　　2.PFOS致心肌細(xì)胞線粒體損傷作用機(jī)制與促進(jìn)EGFR磷酸化，激活Rictor信號(hào)分子介導(dǎo)HK2結(jié)合至線粒體膜上，促進(jìn)糖酵解通路，提高乳酸產(chǎn)量，降低線粒體膜電位相關(guān);另一方面激活的Rictor信號(hào)分子促進(jìn)SREBP-1裂解導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂肪酸堆積，抑制PGC-1α表達(dá)，進(jìn)而破壞MAM結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵蛋白Mfn2表達(dá)，同時(shí)增加Akt與