基于抗真菌新靶標(biāo)分泌型天冬氨酸蛋白酶和N-肉豆莞蔻酰基轉(zhuǎn)移酶發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化新型小分子抑制劑.pdf

1、真菌感染分為淺表性感染和深部感染。淺表性感染是傳播性多發(fā)病，經(jīng)常反復(fù)發(fā)作，是令患者頭痛的頑疾;深部感染近年來發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重影響和威脅人類生命健康，已成為免疫缺陷患者(HIV感染者、癌癥患者等)致死的重要因素。其中，白念珠菌在侵入性真菌感染中的致死率達20％～40％，且耐藥性念珠菌不斷出現(xiàn)，給抗真菌治療帶來了新的挑戰(zhàn)。目前，針對現(xiàn)有抗真菌靶標(biāo)的臨床藥物均存在一定缺陷，如作用于真菌細胞膜脂質(zhì)的兩性霉素B存在嚴(yán)重的腎毒性，作用于羊毛甾醇

2、14α-去甲基化酶的唑類藥物耐藥性嚴(yán)重等。因此，迫切需要尋找和發(fā)現(xiàn)具有全新作用機制、抗菌譜廣、無交叉耐藥性的新型抗真菌先導(dǎo)化合物。
　　本論文基于抗真菌新靶點分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Secreted aspartic protease2，Sap2)，建立Sap2抑制劑篩選模型，通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)了全新結(jié)構(gòu)類型Sap2小分子抑制劑，并在此基礎(chǔ)上開展了優(yōu)化設(shè)計、構(gòu)效關(guān)系及體內(nèi)外抗真菌活性研究。此外，還針對抗真菌新靶標(biāo)N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶

3、(N-Myristoyltransferase，NMT)，對其抑制劑FTR1335開展了結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究。
　　一、新型Sap2抑制劑的虛擬篩選和生物活性研究
　　Sap2活性位點空腔大、柔性強，合理設(shè)計小分子抑制劑具有較大的挑戰(zhàn)性。采用GOLD軟件作為篩選工具，通過基于分子對接的虛擬篩選從Specs數(shù)據(jù)庫中得到45個候選化合物。其中，18個化合物在100μM時的酶抑制率大于40％?；衔顰8、A12、A39和A40等

4、表現(xiàn)出中等或以上強度的抑酶活性，其中化合物A40抑酶活性最佳(IC50=13.78μM)。通過分子對接和分子動力學(xué)模擬，初步闡明了活性化合物的作用模式，發(fā)現(xiàn)它們主要通過氫鍵、疏水和π-π相互作用與Sap2結(jié)合。所發(fā)現(xiàn)的Sap2抑制劑在體外不具有抗真菌活性，與毒力因子的作用機制相吻合。在線蟲真菌感染模型活性測試中，化合物A12和A40顯示了優(yōu)秀的體內(nèi)抗真菌活性，可作為先導(dǎo)化合物進行優(yōu)化研究。
　　二、新型噻唑酮類Sap2抑制劑的設(shè)計

5、、合成和生物活性研究
　　化合物A40是前期基于虛擬篩選發(fā)現(xiàn)的新型噻唑酮類Sap2抑制劑，對其進一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化，共設(shè)計合成71個全新結(jié)構(gòu)的噻唑酮類衍生物。構(gòu)效關(guān)系研究表明，位于S1'和S1兩個疏水口袋的A、B環(huán)具有良好的骨架構(gòu)成和支撐作用，且苯環(huán)上為4-甲基取代時活性表現(xiàn)最佳;C環(huán)羧基側(cè)鏈?zhǔn)前l(fā)揮活性作用的關(guān)鍵位點，增加了化合物與靶酶的氫鍵相互作用，使抑酶活性得到顯著提高。其中，部分化合物具有較好的抑酶活性(如D7、D8、D12、D1

6、4、D19和D22，IC50值均小于5μM)?；衔顲2和D8對線蟲真菌感染模型具有較好的保護作用，與氟康唑效果相當(dāng)。尤其是化合物D8的抑酶活性達到了nM級(IC50=0.86μM)，并在系統(tǒng)性白念菌感染的小鼠模型中有效?；衔顳8與氟康唑聯(lián)合用藥后，對氟康唑耐藥菌感染的小鼠亦有較好的保護作用，為克服耐藥菌感染提供了一種新策略。
　　三、新型三氨基三嗪類S印2抑制劑的設(shè)計、合成和生物活性研究
　　化合物A12是基于虛擬篩選發(fā)

7、現(xiàn)的新型三氨基三嗪類Sap2抑制劑，對其進一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化，共設(shè)計合成了31個全新結(jié)構(gòu)的衍生物。構(gòu)效關(guān)系研究表明，4位苯環(huán)部分引入取代基對化合物抑酶活性有一定影響;而6位側(cè)鏈引入關(guān)鍵氫鍵結(jié)合基團(-OCH2COOH)，化合物抑酶活性顯著增強，設(shè)計思想得到了分子對接驗證。其中，化合物I30抑酶活性最佳(IC50=9.15μM)，其對線蟲真菌感染模型亦表現(xiàn)出良好的保護作用。
　　四、新型吡唑酮類Sap2抑制劑發(fā)現(xiàn)、設(shè)計、合成和生物活性研究

8、
　　通過對ChemDiv數(shù)據(jù)庫進行Sap2抑制劑的虛擬篩選，得到了50個候選分子，其中8個化合物在100μM時的酶抑制率大于40％?；衔颙16、J28、J29和J41具有中等強度的抑酶活性，其中化合物J29抑酶活性最佳(IC50=5.04μM)。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計合成了30個全新結(jié)構(gòu)的吡唑酮類衍生物。構(gòu)效關(guān)系研究顯示，A環(huán)引入不同取代基對化合物的抑酶活性有一定影響，而B環(huán)羧基側(cè)鏈的引入是保持其活性作用的關(guān)鍵。分子對接結(jié)果表明，高

9、活性化合物（化合物K13和K20）在S3口袋形成了新的氫鍵相互作用，這一發(fā)現(xiàn)為吡唑酮類Sap2抑制劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系探討提供了新的思路。
　　五、新型苯并噻唑類N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶抑制劑的設(shè)計、合成和抗真菌活性研究
　　N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶可以催化肉豆蔻?；鶑娜舛罐ⅤoA轉(zhuǎn)移至真核細胞蛋白或病毒蛋白N端的甘氨酸上，進而形成N-肉豆蔻?；鞍?。NMT已被確證是白念珠菌和新型隱球菌等臨床重要致病真菌繁殖和生存所必須的酶。化

10、合物FTR1335是目前報道的抑酶活性較好的一類NMT抑制劑。
　　本論文進行化合物FTR1335的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系探討。通過骨架躍遷設(shè)計合成四種結(jié)構(gòu)類型共25個衍生物。其中，化合物N1(MIC80=1μg/mL)、N2(MIC80=1μg/mL)、O1(MIC80=0.125μg/mL)對石膏狀小孢子菌的活性均優(yōu)于氟康唑(MIC80=32μg/mL)?；衔風(fēng)9和L14在抗真菌活性、抗真菌譜和化合物溶解性方面均得到良好改善，且

11、化合物L(fēng)14對線蟲真菌感染模型效果明顯，值得進行深入研究。
　　綜上，本論文針對抗真菌新靶標(biāo)Sap2和NMT開展了新型抑制劑研究。通過基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，首次發(fā)現(xiàn)三種全新結(jié)構(gòu)類型的Sap2抑制劑，并對其進行優(yōu)化設(shè)計、構(gòu)效關(guān)系和體內(nèi)外抗真菌活性研究，共得到131個新型Sap2抑制劑，部分化合物具有較高抑酶活性，并且在線蟲或小鼠模型中顯示了優(yōu)秀的體內(nèi)抗真菌活性。這些新型Sap2小分子抑制劑可作為先導(dǎo)化合物研發(fā)新一代抗真菌藥物。通過對N