新型抗生素UDP-3-O-(R-羥基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脫乙酰酶(LpxC)抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及活性研究.pdf

1、研究背景：
　　革蘭氏陰性菌耐藥及耐藥菌感染問(wèn)題已成為公眾健康的最大威脅之一，是21世紀(jì)抗感染領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。因此，尋找具有全新抗菌機(jī)制和抗菌靶點(diǎn)的新型抗菌藥物已迫在眉睫。
　　在革蘭氏陰性菌中，UDP-3-O-(R-羥基十四酰)-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；?LpxC)，是一種鋅離子依賴(lài)性蛋白水解酶，它催化脂質(zhì)A生物合成中最關(guān)鍵一步，為革蘭陰性菌生存和毒力所必需。此外，LpxC酶在革蘭氏陰性菌不同菌株中高度保守，與其它

2、已知鋅蛋白酶相比不具有同源性。因此，LpxC作為抗菌新靶點(diǎn)已成為近年來(lái)抗菌藥物研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域，針對(duì)這一靶標(biāo)設(shè)計(jì)合成抑制劑是當(dāng)前抗菌藥物研究中很有發(fā)展前景的一類(lèi)。
　　目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)、合成及活性篩選
　　對(duì)已有LpxC抑制劑的藥效團(tuán)和定量構(gòu)效關(guān)系總結(jié)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有高活性的LpxC抑制劑都具有共同的結(jié)構(gòu)特征即含有與催化活性中心Zn2+螯合的基團(tuán)（如異羥肟酸等）和與酶的疏水通道之間有效結(jié)合的疏水側(cè)鏈。除上述兩個(gè)主要的抑制劑結(jié)合

3、位點(diǎn)外，還有“UDPbindingsite”這一結(jié)合位點(diǎn)，它對(duì)于促進(jìn)底物與酶的識(shí)別和結(jié)合非常重要，是當(dāng)前LpxC抑制劑設(shè)計(jì)的重要方向之一。在充分調(diào)研文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本研究以LpxC為靶標(biāo)，基于LpxC與其抑制劑作用模式，借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，結(jié)合構(gòu)象限制、電子等排等策略，設(shè)計(jì)了系列新型的LpxC抑制劑。在合成目標(biāo)化合物之前，我們利用SYBYL8.0對(duì)所設(shè)計(jì)的化合物進(jìn)行了對(duì)接打分，結(jié)果顯示大部分化合物分值都接近于甚至超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照。這說(shuō)明了

4、我們?cè)O(shè)計(jì)思路的合理性，為我們的研究提供了理論依據(jù)。
　　合成過(guò)程中，A系列以L-羥脯氨酸為起始原料，經(jīng)過(guò)系列反應(yīng)如酯化、Boc保護(hù)或磺化、SN2親核取代、Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)、縮合反應(yīng)、Sonogashira Coupling、Mitsunobu Reaction等合成帶有羧酸甲酯結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物的前體。B系列以各種L構(gòu)型氨基酸為起始原料，經(jīng)過(guò)系列反應(yīng)如Sonogashira Coupling、酯水解、縮合反應(yīng)、Glaser Co

5、upling等合成帶有羧酸甲酯結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物的前體。C系列分別以?xún)煞N光學(xué)結(jié)構(gòu)的氯霉胺及D-對(duì)甲砜基苯絲氨酸乙酯為起始原料，經(jīng)過(guò)系列反應(yīng)如Boc保護(hù)，羥基的選擇性氧化、Sonogashira Coupling、酯水解、縮合反應(yīng)、Glaser Coupling等合成帶有羧酸甲酯結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物的前體。D系列由B系列的中間體（S)-2-（4-乙炔基苯甲酰胺基）-4-甲硫基-丁酸甲酯經(jīng)硫醚氧化成砜或亞砜與Boc保護(hù)的乙炔苯胺進(jìn)行Glaser

6、Coupling合成帶有羧酸甲酯結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物的前體。最后這些羧酸甲酯前體化合物均通過(guò)酯交換轉(zhuǎn)化成異羥肟酸而得到目標(biāo)化合物。
　　對(duì)所合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行了初步的生物活性評(píng)價(jià)，包括最低抑菌濃度MIC的測(cè)定，抑菌環(huán)試驗(yàn)及體外抑酶活性實(shí)驗(yàn)三方面，以期更準(zhǔn)確地篩選出高活性的LpxC抑制劑。
　　結(jié)果：
　　所有目標(biāo)化合物均由1HNMR、HR-MS等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，經(jīng)Scifinder等文獻(xiàn)檢索工具證實(shí)，所合成的目標(biāo)化合物

7、均為新型化合物，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。四系列化合物都表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陰性菌(E.coilATCC25922和P.aeruginosaATCC27853)的選擇性抑菌作用，對(duì)兩株革蘭氏陽(yáng)性菌（S.A.ATCC25923和MRS.A.ATCC29213）則無(wú)明顯抑菌作用。通過(guò)上述兩株革蘭氏陰性菌株的初篩，對(duì)活性較好的化合物進(jìn)行了三株耐藥菌株（E.coilMDR、P.aeruginosaMDR和E.cloacaeMDR）的MIC測(cè)定。部分目標(biāo)化合物的抑

8、菌活性與陽(yáng)性對(duì)照LPC009相比略弱。對(duì)活性最好的化合物D1和D2還進(jìn)行了大腸桿菌野生型菌株(E.coilW3110)和membrane-compromisedstrain(E.coilCMR300)的MIC的測(cè)定，此部分工作由DukeUniversity完成。
　　此外，對(duì)活性最好的兩個(gè)化合物D1和D2，進(jìn)行了兩株細(xì)菌(E.coilATCC25922和P.aeruginosaATCC27853）的抑菌環(huán)試驗(yàn)。結(jié)果顯示測(cè)試化合物與

9、陽(yáng)性對(duì)照藥LPC009、Levofloxacin、Claforan抑菌活性相當(dāng)。
　　LpxC抑制劑的酶活測(cè)定方法條件比較苛刻，故根據(jù)上述MIC的測(cè)定結(jié)果，選取抗菌活性最好的兩個(gè)化合物D1和D2進(jìn)行EcLpxC的酶活測(cè)定，此部分工作由DukeUniversity完成，活性結(jié)果表明所測(cè)兩個(gè)化合物與陽(yáng)性對(duì)照LPC028的抑酶活性相當(dāng)，可作為抗革蘭陰性菌先導(dǎo)進(jìn)行深入研究。
　　結(jié)論：
　　本研究基于LpxC的晶體結(jié)構(gòu)及抑制劑