橙色粘球菌type Ⅳ pilus蛋白間的相互作用暨Na+-H+ antiporter和外膜蛋白影響鹽環(huán)境下多細(xì)胞行為的遺傳分析.pdf

1、粘細(xì)菌是δ-分支變形菌門革蘭氏陰性細(xì)菌，細(xì)胞的多細(xì)胞行為是通過(guò)滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)組織和驅(qū)動(dòng)細(xì)胞在固體界面完成的。利用TypeⅣ pilus(T4P)作為運(yùn)動(dòng)馬達(dá)在固體界面上驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞群體運(yùn)動(dòng)(1)。T4P介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)的機(jī)制是與單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相對(duì)獨(dú)立并且利用完全不同的運(yùn)動(dòng)機(jī)制。T4P定位于Myxococcus xanthus細(xì)胞兩極中的極性端。Myxococcus xanthus的群體(S)運(yùn)動(dòng)，γ-變形菌門Pseudomonasaerugino

2、sa和β-變形菌門Neisseria meningitides，Neisseria gonorrhoeae(2，3)的twitching運(yùn)動(dòng)是通過(guò)T4P產(chǎn)生的收縮力推動(dòng)細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)的。M.xanthus的TypeⅣpilus(T4P)是目前已知的最強(qiáng)的生物馬達(dá)，單根pilus能夠產(chǎn)生超過(guò)100pN的力，這個(gè)力足夠推動(dòng)細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)。Myxococcus xanthus的群體(S)運(yùn)動(dòng)另外還需要胞外多糖(EPS)，因?yàn)榘舛嗵侨笔蛔冎曛惺?/p>

3、沒(méi)有S運(yùn)動(dòng)的。目前群體運(yùn)動(dòng)的模型是，當(dāng)T4P伸出細(xì)胞的極性末端與胞外多糖(EPS)相互連接時(shí)，極性端的T4P收縮從而使得細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)。這里所說(shuō)的胞外多糖是指細(xì)胞表面的胞外多糖或者是滑動(dòng)介質(zhì)表面的胞外多糖。目前，許多T4P的關(guān)鍵組分已經(jīng)被鑒定出來(lái)，T4P的復(fù)合物也不斷的被發(fā)現(xiàn)，例如，P.aeruginosa和Neisseria是中由PilM，PilN，PilO和PilP形成的內(nèi)膜復(fù)合物。對(duì)于M.xanthus T4P蛋白是以何種形式形成復(fù)

4、合物驅(qū)動(dòng)群體運(yùn)動(dòng)仍然是一個(gè)有待研究的領(lǐng)域。Myxococcus xanthus提供了一個(gè)很好的研究T4P的模型，不僅是因?yàn)槿后w滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)是由T4P所驅(qū)動(dòng)的，而且T4P在胞外多糖(EPS)的產(chǎn)生中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在本論文中，粘細(xì)菌T4P蛋白通過(guò)遺傳學(xué)、酵母雙雜交和細(xì)菌雙雜交等的手段進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)的PilB點(diǎn)突變，能夠在沒(méi)有pili的情況下恢復(fù)部分的EPS產(chǎn)生。PilB點(diǎn)突變恢復(fù)胞外多糖實(shí)驗(yàn)來(lái)分析抑制子能否在pil基因的缺失突

5、變株中抑制胞外多糖缺失，結(jié)果暗示著T4P可能存在著整合的T4P復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這個(gè)可能的復(fù)合物結(jié)構(gòu)包括外膜蛋白PilQ蛋白，內(nèi)膜穿膜蛋白PilN蛋白，PilO蛋白和PilC蛋白，以及錨定在內(nèi)膜的脂蛋白PilP。細(xì)胞質(zhì)的PilM和PilB蛋白可能也與復(fù)合物以某種相互作用。這種結(jié)構(gòu)是能夠連接內(nèi)膜，周質(zhì)空間和外膜的。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)可以存在在pilus缺失的情況下。系統(tǒng)的酵母雙雜交對(duì)于核心的關(guān)鍵T4P蛋白組分之間的直接的相互作用進(jìn)行了分

6、析，將10個(gè)關(guān)鍵組分的全序列或者是部分序列分別與酵母雙雜交的激活結(jié)構(gòu)域或者結(jié)合結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)載體連接構(gòu)建了一系列的融合質(zhì)粒。利用酵母雙雜交系統(tǒng)的mating方法對(duì)這一系列的關(guān)鍵組分潛在的相互作用進(jìn)行了大規(guī)模的篩選。酵母雙雜交結(jié)果提供了直接的相互作用證據(jù)在內(nèi)膜和外膜蛋白面向細(xì)胞周質(zhì)空間的區(qū)域的相互作用。發(fā)現(xiàn)了M.xanthus Pil蛋白間存在的相互作用:1）PilB-PilB，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了PilB的N末端與C末端的相互作用。以及PilB的

7、Walker A和Walker B中點(diǎn)突變對(duì)于PilB的N末端與C末端的相互作用的負(fù)影響等。2）我們發(fā)現(xiàn)了PilC-PilC之間的相互作用，值得注意的是，PilC的相互作用是具有其自身的特異性，簡(jiǎn)單的PilC的N末端與C末端是不存在相互作用的。我們利用一個(gè)linker將N末端與C末端連接（不包含穿膜區(qū)域），發(fā)現(xiàn)PilCNlinkerCC與PilCNlinkerCC具有相互作用，另外，PilCNlinkerCC與PilCClinkerCC

8、同樣具有相互作用，結(jié)果暗示著PilC的相互作用需要N末端與C末端的同時(shí)存在。3）PilQ-PilQ，PilP-PilQ，PilP-PilO和PilO-PilN蛋白間的相互作用。外膜蛋白PilQ蛋白，內(nèi)膜穿膜蛋白PilN蛋白，PilO蛋白，以及錨定在內(nèi)膜的脂蛋白PilP。這四個(gè)蛋白的相互作用使得外膜PilQ蛋白能夠與內(nèi)膜的T4P蛋白進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)有了可能。鑒于變形菌門中多種細(xì)菌間均存在著T4P的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了非變形菌門中的Th

9、ermus thermophiles細(xì)菌T4P蛋白間是否存在著T4P結(jié)構(gòu)復(fù)合物。通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)分析我們獲得了PilQ-PilQ，PilW-PilQ，PilW-PilO和PilO-PilN蛋白間的相互作用。值得注意的是，PilW與M.xanthus中PilP蛋白間不存在任何的相似性。同時(shí)，PilW-PilQ與M.xanthus中PilP-PilQ蛋白間的相互作用的作用的位點(diǎn)是不同的，這說(shuō)明相似的蛋白間的相互作用存在T4P在非變形菌門中

10、存在，盡管在Thermus thermophiles和Myxococcus xanthusPilQ蛋白存在著顯著的序列差異性，暗示著不同的菌株間仍然存在著各自的特異性，相互作用的位點(diǎn)因菌株不同而有所不同。Myxococcus xanthus對(duì)于T4P的結(jié)構(gòu)復(fù)合物存在著許多模型，本論文是第一次給出直接的證據(jù)證明T4P蛋白自身和蛋白間存在著相互作用。變細(xì)菌門和非變形菌們的細(xì)菌中，在沒(méi)有pilus存在的前提下仍然存在著從內(nèi)膜穿過(guò)周質(zhì)空間到外膜

11、的整合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這種復(fù)合物在EPS產(chǎn)生中的調(diào)節(jié)支路中的作用解釋了復(fù)合物存在的原因。
　　粘細(xì)菌大規(guī)模的細(xì)胞協(xié)同作用展現(xiàn)復(fù)雜的社會(huì)行為。成千上萬(wàn)的細(xì)胞應(yīng)答貧瘠環(huán)境通過(guò)滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)協(xié)同運(yùn)動(dòng)形成子實(shí)體，在這個(gè)過(guò)程當(dāng)中營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分化形成環(huán)境抗逆性孢子。粘細(xì)菌的多細(xì)胞行為也包括swarming，rippling和捕食(4)。M.xanthus細(xì)胞是不能夠在液體中運(yùn)動(dòng)的，這種陸生細(xì)菌能夠在固體的介質(zhì)表面進(jìn)行滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)。當(dāng)這些細(xì)胞在液體環(huán)境中靜置培

12、養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)搖瓶的壁上形成生物膜。將營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基替換成貧瘠培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞聚集，隆起并形成子實(shí)體，M.xanthus細(xì)胞是通過(guò)胞內(nèi)外的信號(hào)調(diào)控過(guò)程完成多細(xì)胞行為和生孢的過(guò)程。細(xì)胞同步的協(xié)同運(yùn)動(dòng)完成了預(yù)先調(diào)控的發(fā)育過(guò)程。實(shí)驗(yàn)室在90年代中期發(fā)現(xiàn)的一株能夠耐受海水的粘細(xì)菌，Myxococcus fulvus HW-1(ATCC BAA-855)與典型的陸生菌株的社會(huì)學(xué)行為有著一定的不同。在低濃度海水條件下，其與典型的陸生菌DK1622表現(xiàn)類似的

13、生活模式:細(xì)胞密度依賴性，固體貧瘠培養(yǎng)基上細(xì)胞聚集形成典型的子實(shí)體，子實(shí)體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分化形成孢子。但隨著海水濃度的提高，HW-1的生長(zhǎng)模式變化，貧瘠培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞不經(jīng)過(guò)子實(shí)體的形成，直接形成粘孢子(5)。HW-1與M.xanthus的類似的生活模式使得我們可以對(duì)比分析來(lái)對(duì)HW-1進(jìn)行深入的了解，以及HW-1相對(duì)M.xanthus差異明顯的生活模式轉(zhuǎn)變，這種獨(dú)特的轉(zhuǎn)變機(jī)制的使得HW-1可以作為研究海洋粘細(xì)菌的模式菌株。實(shí)驗(yàn)室為研究HW

14、-1的這種適應(yīng)性進(jìn)化的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)室前期利用隨機(jī)轉(zhuǎn)座質(zhì)粒對(duì)HW-1進(jìn)行隨機(jī)突變獲得的300多株多細(xì)胞行為和鹽應(yīng)答異常的突變株。其中存在著一株突變株引起了我們的興趣，我們命名為YLH0402。對(duì)突變株進(jìn)行了社會(huì)學(xué)行為的分析發(fā)現(xiàn)，YLH0402突變株導(dǎo)致菌株由聚團(tuán)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚⑸L(zhǎng)，并且通過(guò)鈣熒光白染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分散生長(zhǎng)的原因是由于其胞外基質(zhì)物質(zhì)的急劇減少所導(dǎo)致的。而貧瘠條件下的多細(xì)胞子實(shí)體結(jié)構(gòu)形成能力喪失，耐鹽能力也有明顯的降低。通過(guò)Sou

15、thern blot和質(zhì)粒自營(yíng)救實(shí)驗(yàn)我們確認(rèn)的唯一的插入位點(diǎn)在一個(gè)Na+/H+ antiporter基因。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，插入基因與M.xanthus中相應(yīng)的同源基因以及上下游基因存在著很高的同源性。在M.xanthus中相應(yīng)基因的插入失活顯示著子實(shí)體形成的延遲和異常，生孢能力也有所降低。半定量的RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示M.xanthus中插入基因與其臨近的共七個(gè)基因是共轉(zhuǎn)錄的。這個(gè)基因簇內(nèi)的基因的逐個(gè)敲除對(duì)于社會(huì)性行為并沒(méi)有顯著的降低

16、，整個(gè)基因簇的敲除顯示著生長(zhǎng)的嚴(yán)重延遲，子實(shí)體形成異常，形成的孢子數(shù)目略有降低但孢子萌發(fā)率則顯著降低，暗示著形成的孢子存在著嚴(yán)重的缺陷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示著這個(gè)基因簇在維持耐鹽能力和多細(xì)胞子實(shí)體結(jié)構(gòu)存在著重要的作用，暗示這個(gè)基因簇可能在HW-1環(huán)境改變導(dǎo)致的適應(yīng)機(jī)制的轉(zhuǎn)換上發(fā)揮著重要的作用。實(shí)驗(yàn)室前期微陣列技術(shù)獲得的在海水和淡水條件下HW-1中表達(dá)差異的外膜蛋白，我們對(duì)這些表達(dá)差異的外膜蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，這對(duì)我們?cè)诤暧^上理解HW-1的環(huán)

17、境適應(yīng)性機(jī)制的轉(zhuǎn)化機(jī)制提供了可能。HW-1中表達(dá)差異蛋白與M.xanthus的同源基因的比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們存在著高度的同源性。序列的高度同源性暗示著功能的相似性，在此基礎(chǔ)上，我們利用基因敲除和插入的方法獲得了M.xanthus中同源基因的基因缺失突變株或者是不同差異表達(dá)基因的雙敲除突變株并進(jìn)行了在海水和淡水條件下發(fā)育和運(yùn)動(dòng)等的性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因均在社會(huì)性行為中發(fā)揮著重要的作用，暗示著這些基因參與了HW-1細(xì)胞的環(huán)境適應(yīng)性過(guò)程。微陣列技術(shù)在