雞AvBD7成熟肽在大腸桿菌中的表達及抗菌活性分析.pdf

1、AvBD7成熟肽是一種擁有42個氨基酸殘基的雞β-防御素，屬于陽離子抗菌多肽(Cationicantimicrobialpeptides，CAMPs)，是雞體內先天性和獲得性免疫的重要成分。它具有抑菌譜廣、抗菌力強且不易使病原微生物產生抗藥性等優(yōu)點，是一種具有非常良好應用前景的“抗生素替代品”，如何對其進行大規(guī)模生產應用已成為目前的研究熱點。
　　 為了探索雞β-防御素在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達水平及體外抑菌活性情況，本研究以雞

2、AvBD7作為研究對象，應用基因工程技術，將人工合成的AvBD7成熟肽基因克隆并插入載體pGEX-6P-1中，構建成功重組的pGEX-6P-AvBD7大腸桿菌工程菌。通過優(yōu)化表達條件獲得大量的可溶性融合蛋白GST-AvBD7，用Prescission蛋白酶切除GST標簽并純化得到的雞AvBD7成熟肽具有較好的抗菌活性。具體研究內容和結果如下：
　　 1.構建表達AvBD7成熟肽的大腸桿菌工程菌
　　 根據GenBank中

3、登記的雞β-防御素序列(登錄號DQ858344)人工合成雞AvBD7成熟肽基因序列，設計1對引物P1(5′端含有EcoRI酶切位點)和P2(5′端含有SalI酶切位點)用于PCR擴增雞AvBD7成熟肽基因片段，把PCR擴增出的雞AvBD7成熟肽基因片段和pGEX-6P-1載體分別進行雙酶切后連接，構建成功pGEX-6P-1-AvBD7成熟肽表達載體并轉化大腸桿菌BL21(DE3)。
　　 2.雞AvBD7成熟肽的表達、純化及鑒定

4、
　　 將測序正確的E.coliBL21(DE3)/pGEX-6P-AvBD7接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp終濃度為100μg/ml)，經IPTG誘導表達出GST-AvBD7融合蛋白，SDS-PAGE檢測分子量約為31kD。為了提高蛋白的可溶性表達量，經過摸索不同的表達條件發(fā)現，在16℃120rpm/min經0.1mmoL的IPTG誘導約24h后可溶性融合蛋白GST-AvBD7得到最佳表達。將GST-AvBD7融合蛋白經過親和層析

5、、超濾、C18ZipTip層析后進行MALDI-TOF-MS質譜分析，MALDI-TOF-MS質譜分析鑒定出蛋白分子量為5516Da，此分子量與形成2個二硫鍵的AvBD7成熟肽的理論分子量相符。
　　 3.雞AvBD7成熟肽的抗菌活性分析
　　 采用打孔擴散法檢測純化得到的雞成熟肽AvBD7對各個指示菌的抑菌情況，結果發(fā)現：純化得到的雞成熟肽AvBD7對黃色微球菌(NCIB8166)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)

6、、糞腸鏈球菌(ATCC29212)、大腸桿菌(CMCC44102)都有抑菌活性。但是，雞β-防御素AvBD7成熟肽對白色念珠菌(ATCC10231)和白色念珠菌(ATCC90029)無抑菌作用。用BCA蛋白檢測試劑盒測純化得到的雞AvBD7成熟肽(質譜分析鑒定正確)的蛋白濃度，再根據Levengood等人的方法測量純化得到的雞AvBD7成熟肽對不同指示菌的最小抑菌濃度(MIC)，結果顯示：對黃色微球菌(NCIB8166)、金黃色葡萄球菌

7、(ATCC25923)、糞腸鏈球菌(ATCC29212)、大腸桿菌(CMCC44102)的最低抑菌濃度分別為16.875、67.5、67.5、135mg/L；用純化得到的高濃度(>540mg/L)雞AvBD7成熟肽對兩株真菌白色念珠菌(ATCC10231)和白色念珠菌(ATCC90029)進行最低抑菌濃度實驗發(fā)現沒有抑菌活性產生。由此可知，體外條件下純化得到的雞β-防御素AvBD7成熟肽只對一些特定的指示菌具有抑菌活性。