vMIP-Ⅱ在大腸桿菌表達、純化的條件優(yōu)化及活性鑒定.pdf

1、　　目的：本研究主要對病毒基因來源的人趨化因子同源物vMIP-Ⅱ在原核細胞的表達及純化條件進行優(yōu)化,并對其活性進行鑒定,為大量獲取單鏈vMIP-Ⅱ和將其用于趨化因子受體封閉因子的臨床應用打下基礎。
　　方法：本實驗對已克隆轉化的菌株進行誘導,并用Amylose resin親和純化目的蛋白,再經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析純化結果,以Transwell趨化小室和FN包被的96孔板對vMIP-Ⅱ的生物學活性進行鑒定。

2、用MTT法檢測vMIP-Ⅱ對外周血單個核細胞的毒性及對細胞增殖的影響。
　　結果：vMIP-Ⅱ/MBP融合蛋白在大腸桿菌中呈高效分泌型表達,SDS-PAEG可見在54KD位置有一明顯的誘導表達條帶。最佳誘導條件為：TB培養(yǎng)基、0.3mmol/L IPTG、28℃誘導4h。免疫印記結果顯示在54KD位置有一明顯的藍染條帶。該菌的最佳純化條件為：30%的P2緩沖液,MgSO4用量為50ml/g濕菌,濃度為5mmol/L。該法獲得的融合

3、蛋白酶切后得到的單體活性較高,對PBMC趨化、黏附特性的抑制率達50%以上。vMIP-Ⅱ的細胞毒性較低,對PHA刺激的淋巴細胞的增殖性應答沒有抑制作用。
　　結論：1.溫度及培養(yǎng)基類型影響vMIP-Ⅱ/pMAL轉化菌在大腸桿菌中的表達效果。IPTG濃度對該菌誘導表達量無明顯影響。
　　2.由于MBP標記蛋白C端融合,Western blot檢測到MBP抗原性,說明該載體成功誘導表達MBP融合蛋白,沒有出現(xiàn)錯誤的轉錄終止。