FoxO3a表達(dá)下調(diào)對人腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響.pdf

1、目的：
　　1.檢測 FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子是否與人腎小管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)；
　　2.探討在人腎小管上皮細(xì)胞中FoxO3a是否通過調(diào)節(jié)β-Catenin對細(xì)胞EMT產(chǎn)生影響。
　　方法：
　　1.10 ng/ml的 TGF-β1處理 HK-2細(xì)胞后采用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting）檢測檢測E-cadherin、Vimentin、α-SMA表達(dá)量變化；
　　2.利用

2、免疫熒光染色法檢測Vimentin、α-SMA的表達(dá)量變化，以及藥物處理后細(xì)胞的形態(tài)變化；
　　3.應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blotting）分析EMT細(xì)胞中FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表達(dá)量的變化；
　　4.使用激光共聚焦顯微鏡檢測TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞后，F(xiàn)oxO3a在細(xì)胞中的亞分布變化；
　　5.將FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)入HK-2細(xì)胞后，通過采用蛋白免疫印跡技術(shù)（Western bl

3、otting）和RT-PCR檢測FoxO3a是否敲低成功，Western blotting檢測E-cadherin、α-SMA表達(dá)量變化，驗(yàn)證FoxO3a對細(xì)胞EMT程度的影響；
　　6.應(yīng)用 Western blot與免疫熒光染色法檢測 EMT細(xì)胞與 FoxO3a敲低細(xì)胞中β-Catenin的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1. TGF-β1處理HK-2細(xì)胞后，Western blotting檢測顯示E-Cadherin

4、表達(dá)顯著降低（P＜0.01），Vimentin、α-SMA表達(dá)量增加（P＜0.05）；免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)表明Vimentin、α-SMA蛋白的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，細(xì)胞由上皮細(xì)胞呈現(xiàn)的“鋪路石”橢圓結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形纖維細(xì)胞形態(tài)，證明EMT細(xì)胞模型建立成功。
　　2.蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明發(fā)生 EMT的 HK-2細(xì)胞中，F(xiàn)oxO3a表達(dá)量降低（P＜0.01），而p-FoxO3a則顯著升高（P＜0.05），表明FoxO3a與腎小管細(xì)胞EMT過

5、程相關(guān)。
　　3.激光共聚焦結(jié)果顯示與正常HK-2細(xì)胞相比，EMT細(xì)胞中胞核FoxO3a含量減少，而胞質(zhì)中FoxO3a表達(dá)量顯著。
　　4. Western blotting和RT-PCR結(jié)果分析得出轉(zhuǎn)染FoxO3a-siRNA后，細(xì)胞中的FoxO3a表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），且E-Cadherin表達(dá)顯著降低（P＜0.01），α-SMA表達(dá)量增加（P＜0.05），細(xì)胞出現(xiàn)EMT現(xiàn)象。表明FoxO3a含量降低，能促使人

6、腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　5. Western blotting和免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示 EMT細(xì)胞與 FoxO3a敲低的細(xì)胞中β-Catenin的表達(dá)都顯著升高，說明降低轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a的表達(dá)，可以促使β-Catenin蛋白的表達(dá)量增加，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
　　結(jié)論：
　　1.轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a與HK-2細(xì)胞的EMT過程有關(guān)。并且TGF-β1誘導(dǎo) FoxO3a轉(zhuǎn)位出核，抑制FOXO3a的表達(dá)可以使HK-