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文檔簡介
1、目的:
建立Ⅰ型糖尿病腎病小鼠模型,主要研究:1、觀察Ⅰ型糖尿病腎病小鼠模型腎小管上皮細胞線粒體自噬情況;2、觀察線粒體自噬調(diào)節(jié)蛋白Nix在Ⅰ型糖尿病腎病小鼠模型中腎小管上皮細胞的表達及分布情況。
方法:
(1)動物分組及建模:將17只雄性ICR小鼠隨機分為正常對照組(Control組,n=5)、糖尿病腎病模型組(STZ組,n=6)和糖尿病腎病藥物3-MA干預(yù)組(STZ+3-MA組,n=6),成模后予以藥物
2、干預(yù)并在第八周末宰殺小鼠取出腎臟實驗;
(2) RT-PCR方法檢測Nix的mRNA表達情況;
(3)免疫組織化學(xué)、Western blot方法檢測LC3-Ⅱ、P62和Nix的蛋白表達情況;
(4)免疫熒光共定位檢測線粒體標(biāo)記物VDAC與自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3共定位情況;
(5)電鏡觀察腎小管上皮細胞線粒體自噬現(xiàn)象。
結(jié)果:
(1)成功構(gòu)建Ⅰ型DKD小鼠模型:72小時后尾靜脈采血,
3、當(dāng)空腹血糖維持在13.9mmol/L或隨機血糖維持在16.7mmol/L以上,則認(rèn)為糖尿病模型成模。且在8周末時,糖尿病腎病小鼠的血糖顯著高于正常對照組;光鏡及電鏡可見腎小球肥大,部分腎小球系膜細胞增生、系膜基質(zhì)增多,腎小管擴張。
(2) STZ小鼠腎組織LC3-Ⅱ、P62、Nix蛋白表達:Westem blot顯示STZ組小鼠較正常對照組小鼠腎臟p62、LC3-Ⅱ、Nix表達上調(diào)(P<0.05);而自噬抑制劑3-MA干預(yù)的S
4、TZ小鼠則較STZ小鼠腎臟組織p62、LC3-Ⅱ表達下調(diào)(P<0.05),Nix表達下降,但無統(tǒng)計學(xué)差異;免疫組化結(jié)果與Westem blot結(jié)果一致,且該四種蛋白主要在腎小管上皮細胞表達。
(3)免疫熒光示STZ小鼠腎臟組織(主要是腎小管上皮細胞)線粒體外膜蛋白VDAC與自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ共定位增加,而自噬抑制劑3-MA干預(yù)的STZ小鼠則較糖尿病腎病小鼠腎臟組織VDAC與LC3-Ⅱ共定位減少。
(4)電鏡技術(shù)觀
5、察到STZ組小鼠腎小管上皮細胞線粒體自噬現(xiàn)象,而正常對照組及3-MA+STZ組并未觀察到線粒體自噬現(xiàn)象。
結(jié)論:
(1)糖尿病腎病小鼠腎組織(主要是腎小管上皮細胞)存在線粒體自噬相關(guān)蛋白表達異常;
(2) STZ小鼠腎臟腎小管上皮細胞存在線粒體自噬現(xiàn)象;
(3) STZ小鼠腎臟組織(主要是腎小管上皮細胞)Nix表達異常,表現(xiàn)為Nix表達上調(diào)。
綜上,線粒體自噬異??赡芘c糖尿病腎病發(fā)病機制
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