高脂膳食性氧化應(yīng)激對(duì)淋巴細(xì)胞功能抑制機(jī)制的研究.pdf

1、由于生活水平的提高,膳食結(jié)構(gòu)改變,高能量密度膳食攝入比例逐步增加。能量攝入的增加,體內(nèi)能量代謝增強(qiáng),其副產(chǎn)物ROS生成也隨之增多,誘發(fā)機(jī)體形成氧化應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)高能膳食可降低機(jī)體的免疫功能,導(dǎo)致病毒感染和癌癥的發(fā)病率逐年增高。由于高脂食物攝入比例增高導(dǎo)致的機(jī)體ROS生成的增加,可能是影響淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)模式和功能狀態(tài)的主要原因。目前,還少有研究報(bào)道膳食性氧化應(yīng)激抑制淋巴細(xì)胞功能的內(nèi)在產(chǎn)生機(jī)制。本文旨在探討高脂膳食性氧化應(yīng)激對(duì)淋巴細(xì)胞能

2、量和功能狀態(tài)影響的分子機(jī)制,以及抗氧化劑硫辛酸通過(guò)清除ROS,改變機(jī)體的氧化還原狀態(tài)對(duì)淋巴細(xì)胞功能障礙的干預(yù)作用。
　　 1.高脂膳食性氧化應(yīng)激對(duì)淋巴細(xì)胞功能和數(shù)量的影響
　　 通過(guò)檢測(cè)外周血、空腸、胸腺和脾臟的氧化還原指標(biāo),研究長(zhǎng)期高脂膳食對(duì)免疫組織氧化還原狀態(tài)的影響。C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(2％豬油);高脂組(HFD,19.5％豬油);硫辛酸干預(yù)組(HFD+0.1％LA),喂飼10周。結(jié)果顯示長(zhǎng)期

3、高脂膳食使免疫組織內(nèi)的抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性顯著降低,伴隨ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量顯著升高,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的TAC能力減弱,GSH/GSSG比值顯著降低。結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)期高脂膳食使免疫組織內(nèi)的ROS生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡被破壞,形成氧化應(yīng)激。抗氧化劑硫辛酸通過(guò)清除ROS、提高抗氧化酶的活力可有效改善免疫組織內(nèi)的氧化還原失衡的狀態(tài)。
　　 通過(guò)檢測(cè)外周血和脾臟內(nèi)CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群比值、B細(xì)胞百分含量、淋巴

4、細(xì)胞凋亡率、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、以及血漿中促炎性細(xì)胞因子IL-6、INF-α、IFN-γ和抑炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-10的含量,探討長(zhǎng)期膳食性氧化應(yīng)激對(duì)淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能狀態(tài)的影響。結(jié)果表明高脂膳食性氧化應(yīng)激可顯著抑制淋巴細(xì)胞的功能表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、CD4+/CD8+比值和B細(xì)胞的百分含量顯著降低,同時(shí)淋巴細(xì)胞凋亡率顯著升高。此外,HFD組小鼠血漿中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量顯著高于對(duì)照組,而IL-4、IL-10的含量顯

5、著低于對(duì)照組,說(shuō)明高脂膳食性氧化應(yīng)激可導(dǎo)致促炎性與抑炎性細(xì)胞因子分泌失衡,誘發(fā)機(jī)體形成慢性炎癥。硫辛酸通過(guò)清除ROS,恢復(fù)氧化還原平衡,緩解機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài),從而改善淋巴細(xì)胞的功能。
　　 2.高脂膳食性氧化應(yīng)激對(duì)淋巴細(xì)胞功能抑制的分子機(jī)制
　　 從基因的轉(zhuǎn)錄水平全面分析由高脂膳食介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞功能障礙的分子機(jī)制。利用affymetrix MOE430A基因芯片分析長(zhǎng)期高脂膳食和LA干預(yù)對(duì)脾臟基因表達(dá)模式的影響,并使用

6、On-tools在線分析軟件同時(shí)結(jié)合KEGG基因網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析了顯著改變的基因通路。芯片結(jié)果顯示,長(zhǎng)期高脂膳食導(dǎo)致細(xì)胞生理過(guò)程(包括MAPK、細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞骨架、細(xì)胞緊密連接、胰島素信號(hào)等),淋巴細(xì)胞功能(包括TCR、BCR、細(xì)胞因子受體)和固有免疫功能(包括Toll樣受體、自然殺傷細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞毒性),以及抗氧化防御體系等多個(gè)通路中相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著改變,多數(shù)呈下調(diào)趨勢(shì)。通路分析結(jié)果提示,長(zhǎng)期高脂膳食可通過(guò)抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

7、,降低淋巴細(xì)胞內(nèi)能量生成,從而減弱淋巴細(xì)胞受體的信號(hào)傳遞。同時(shí)通過(guò)上調(diào)促凋亡基因(Dffb、Fadd),下調(diào)抗凋亡基因(Arhgdig、Bcl2115)的表達(dá)使淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。LA通過(guò)清除ROS,恢復(fù)具有抗氧化功能的酶或蛋白的基因表達(dá)水平,緩解膳食性氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷,并通過(guò)下調(diào)凋亡信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)和恢復(fù)免疫反應(yīng)和能量代謝相關(guān)基因表達(dá),改善免疫細(xì)胞的功能。
　　 通過(guò)檢測(cè)腸道中分泌型免疫球蛋白SIgA的

8、分泌水平,同時(shí)利用基因芯片檢測(cè)空腸派伊爾結(jié)與抗氧化防御體系、TCR、BCR、抗原提呈信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)水平,探討膳食性氧化應(yīng)激對(duì)腸道黏膜免疫功能抑制作用的分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示,高脂膳食可顯著下調(diào)空腸派伊爾結(jié)內(nèi)包括抗氧化防御體系、TCR(包括Il2ra、Syk、Lck、Cd28、Cd86)、BCR(包括Cd19、Cr2、Ighg、Igh-6、Cd79b)、抗原提呈(包括H2-Oa、H2-M3)信號(hào)通路中多個(gè)基因的表達(dá)。同時(shí)腸道內(nèi)S

9、IgA的分泌水平顯著降低也證明了高脂膳食性氧化應(yīng)激可抑制派伊爾結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞的抗原提呈和抗體的分泌功能。LA干預(yù)可通過(guò)清除ROS、改善氧化還原平衡狀態(tài)而有效地保護(hù)腸道粘膜免疫功能。
　　 3.高脂膳食性氧化應(yīng)激對(duì)脾臟蛋白表達(dá)的影響
　　 通過(guò)使用比較蛋白質(zhì)組的研究方法從蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步探討由高脂膳食導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞功能障礙的分子機(jī)制。雙向電泳分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,共有20個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)變化顯著(Fc＞3)。MALDI

10、-TOF MS鑒定結(jié)果顯示,這些表達(dá)顯著變化的蛋白在包括細(xì)胞能量和物質(zhì)代謝(ACO2、TKT)、氧化應(yīng)激(PRDX1)、細(xì)胞骨架(CORONIN、VIM)、細(xì)胞凋亡(HLX、DAPK1)、細(xì)胞周期(CITRON-K、GPRIN1)等多種細(xì)胞功能中具有重要的作用。LA通過(guò)清除ROS、上調(diào)抗氧化蛋白PRDX的表達(dá)水平,恢復(fù)胞內(nèi)氧化還原平衡,可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)能量代謝和生物大分子合成。
　　 4.淋巴細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)對(duì)其效應(yīng)功能及能量水平

11、的影響
　　 通過(guò)研究不同周期高脂膳食對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)ATP水平、線粒體功能和淋巴細(xì)胞效應(yīng)功能的影響,從細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證高脂膳食介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞功能障礙的產(chǎn)生機(jī)制。結(jié)果顯示3周高脂膳食使T、B細(xì)胞內(nèi)的ATP水平和轉(zhuǎn)化率顯著升高。而隨著高脂膳食周期延長(zhǎng),淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率和ATP水平顯著降低,同時(shí)胞內(nèi)H2O2和MDA水平顯著升高,伴隨GSH/GSSG比值和線粒體膜電位降低,說(shuō)明高脂膳食可影響淋巴細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài),并影響線粒體的功能

12、。LA通過(guò)清除ROS,保護(hù)線粒體免受氧化損傷,使其在高能量代謝的環(huán)境中維持正常的生理功能。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示高脂膳食可顯著改變淋巴細(xì)胞內(nèi)與抗氧化防御體系(Mt-1、Prdx1、Prdx4)、T細(xì)胞增殖(Il2、Ilr2α)、BCR(CD19、Igh-6)以及糖吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(Inr、Slc2、Pik3cd、Akt3、Rac-1)相關(guān)基因的表達(dá)。隨著高脂膳食的周期延長(zhǎng),淋巴細(xì)胞內(nèi)與糖代謝、抗氧化防御和免疫功能相關(guān)的基因表達(dá)均呈下