基于LM-PCR預(yù)擴(kuò)增法的建立及其在水產(chǎn)品致病菌檢測中的應(yīng)用.pdf

1、基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的基因檢測方法具有高靈敏度與高特異性的優(yōu)點(diǎn),但在對(duì)實(shí)際樣品的檢測中,核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)往往受到樣品中目標(biāo)DNA含量極少、破壞程度高、提取得到的模板含有大量背景核酸等因素制約,導(dǎo)致檢測效率下降,影響了其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。如DNA芯片技術(shù)可短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高通量分析但對(duì)樣品要求較高,此時(shí)樣品數(shù)量及質(zhì)量往往成為制約檢測的首要因素。針對(duì)上述問題,對(duì)樣品DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增(pre-amplification)是有效的解決途徑,如全基因組擴(kuò)

2、增技術(shù)(whole genome amplification, WGA)已在單核苷酸多態(tài)性分析(SNPs)、基因型(genotyping)和基因組測序(genome sequencing)等大規(guī)模分析中發(fā)揮了巨大作用。
　　在現(xiàn)有全基因組擴(kuò)增方法中,連接介導(dǎo)PCR(ligation-mediated PCR, LM-PCR)具有受樣品質(zhì)量影響小、擴(kuò)增效率高的優(yōu)點(diǎn),但其存在模板片段間可能發(fā)生自連的弊端,對(duì)此本研究應(yīng)用mLM-PCR法

3、(modified LM-PCR)解決這一問題,采用IIS型限制性內(nèi)切酶(BbvI和Alw26I)對(duì)模板DNA進(jìn)行酶切產(chǎn)生具有隨機(jī)堿基粘性末端的片段以減少片段間自連的概率,并使用一組含有隨機(jī)堿基的接頭混合物與模板片段進(jìn)行連接,最終使用通用引物實(shí)現(xiàn)基因組的全擴(kuò)增。通過對(duì)副溶血弧菌基因組的全擴(kuò)增結(jié)果顯示,本方法可實(shí)現(xiàn)高靈敏度、均衡的全基因組擴(kuò)增。通過使用特異性PCR以及熒光定量PCR對(duì)全擴(kuò)增效果進(jìn)行評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,與目前廣泛應(yīng)用的MDA法(m

4、ultiple displacement amplification)相比,本方法具有更高的擴(kuò)增效率與擴(kuò)增均衡性,顯示出極高的全擴(kuò)增效率。
　　WGA法對(duì)模板 DNA的純度要求較高,無法應(yīng)用于大量核酸背景中極微量目標(biāo)DNA的預(yù)擴(kuò)增,為此本研究建立了基于mLM-PCR法的選擇性預(yù)擴(kuò)增方法,可實(shí)現(xiàn)大量背景核酸中極微量目標(biāo)DNA的預(yù)擴(kuò)增:
　　(1)通過對(duì)大量金槍魚基因組中極微量副溶血弧菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、腐敗希瓦氏菌的預(yù)擴(kuò)增

5、結(jié)果顯示,通過本方法與普通 PCR法結(jié)合使用可檢測至數(shù)十拷貝目標(biāo)致病菌(目標(biāo)致病菌與背景核酸比例約為10-7),與普通PCR方法相比可將檢測靈敏度提高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)以上;
　　(2)本方法實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)的多重預(yù)擴(kuò)增,針對(duì)上述四種目標(biāo)致病菌的四重預(yù)擴(kuò)增結(jié)果顯示使用多重預(yù)擴(kuò)增法可獲得與單重預(yù)擴(kuò)增法相近的檢測靈敏度,經(jīng)過多重預(yù)擴(kuò)增的產(chǎn)物較適合進(jìn)行特異性多重 PCR檢測,可顯著提高檢測效率;
　　(3)通過使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

6、(LAMP)對(duì)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性擴(kuò)增的結(jié)果顯示,本預(yù)擴(kuò)增方法可成功實(shí)現(xiàn)與 LAMP法聯(lián)用且靈敏度極高,表明預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物可普遍作為 PCR類方法或恒溫核酸擴(kuò)增方法等目前常用特異性核酸擴(kuò)增方法的模板,顯示出其靈活性與普遍適用性;
　　(4)深入探究了接頭結(jié)構(gòu)等因素對(duì)mLM-PCR預(yù)擴(kuò)增體系的影響,并對(duì)預(yù)擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)中關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)如下:
　　a)在一定范圍內(nèi)選擇較長(大于200 bp)的酶切片段作為預(yù)擴(kuò)增目標(biāo);
　　b)

7、在一定范圍內(nèi)接頭特異性越高,預(yù)擴(kuò)增靈敏度越高;
　　c)使用單條通用引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增時(shí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(loop)會(huì)影響 PCR反應(yīng),但影響程度隨模板長度的增長而減小;
　　d)使用較高退火溫度、增加引物濃度、增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)可有效減少莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)預(yù)擴(kuò)增PCR效率的影響;
　　(5)對(duì)人工污染牡蠣樣品中副溶血弧菌的檢測結(jié)果顯示,mLM-PCR預(yù)擴(kuò)增法可成功用于實(shí)際樣品中致病菌的高靈敏度檢測,檢測靈敏度可達(dá)到0.1-1弧菌拷貝/管反應(yīng)