基于氨基修飾的硅包磁性納米粒子分離致病菌核酸的PCR檢測(cè)技術(shù)的建立.pdf

1、食源性致病菌是引發(fā)人類食源性疾病的重要因素，甚至可能導(dǎo)致人類死亡。目前，食源性致病菌的檢測(cè)方法主要是培養(yǎng)法，因?yàn)槠浜臅r(shí)長(zhǎng)，在實(shí)際的應(yīng)用中具有一定的局限性。探究快速的食源性致病菌檢測(cè)方法對(duì)于食品安全的保障有著重要的意義。遺傳物質(zhì)是生命物質(zhì)的關(guān)鍵核心，隨著基因組學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等領(lǐng)域的發(fā)展，分子生物學(xué)將在致病菌檢測(cè)中發(fā)揮越來越強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。然而，用分子方法檢測(cè)食源性致病菌時(shí)，食品成分對(duì)反應(yīng)體系的干擾，以及微量的致病菌核酸難以分離，導(dǎo)致分子檢測(cè)的

2、優(yōu)勢(shì)無法徹底發(fā)揮。在本研究中，用磁性納米粒子（及磁性捕獲探針）對(duì)目標(biāo)菌的核酸進(jìn)行分離，然后結(jié)合PCR對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)食源性致病菌。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1．制備了幾種磁性納米粒子，并對(duì)納米粒子進(jìn)行了 TEM、IR等表征。對(duì)比了在適合下游檢測(cè)的環(huán)境中，氨基修飾的硅包磁性納米粒子（ASMNPs）、硅包磁性納米粒子、羧基修飾的硅包磁性納米粒子三種納米粒子對(duì)于核酸的分離能力。結(jié)果顯示，不論對(duì)于沙門氏菌基因組DN

3、A這樣的雙鏈DNA，還是對(duì)于人工合成的單鏈寡核苷酸序列，在適合下游檢測(cè)的環(huán)境中ASMNP都具有很好的吸附能力。通過考察溫度、pH等對(duì)磁性吸附的影響，推斷靜電作用、氫鍵在其中發(fā)揮了重要的作用。
　　2.以磁性納米粒子為例，探討了納米粒子對(duì)PCR的影響，就抑制效應(yīng)、特異性、效率與產(chǎn)率三個(gè)方面展開研究。發(fā)現(xiàn)：1）抑制作用：裸露的納米粒子可以通過吸附PCR成分而抑制PCR擴(kuò)增，但是當(dāng)表面被封閉之后，這種抑制作用會(huì)被消除。2）特異性：納米粒

4、子不能增加引物錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增，事實(shí)上，隨著納米粒子的增加，長(zhǎng)片段的擴(kuò)增優(yōu)先受到抑制。然而，磁性納米粒子能抑制因?yàn)閿U(kuò)增過早結(jié)束引起的非特異性擴(kuò)增。3）效率與產(chǎn)率：一些納米粒子與 ssDNA較為牢固的結(jié)合，可以促使dsDNA解鏈，而且還有效的阻止了ssDNA復(fù)性。一些與ssDNA強(qiáng)烈結(jié)合的納米粒子會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增的效率與產(chǎn)率提高?？偟膩碚f，納米粒子對(duì)PCR的影響錯(cuò)綜復(fù)雜，是否會(huì)產(chǎn)生積極的影響也是多方面作用之后的結(jié)果。對(duì)于最終的目的而言，納

5、米粒子對(duì)PCR影響主要是通過納米粒子表面實(shí)現(xiàn)的，如果 ASMNP表面進(jìn)行了有效的封閉，可以實(shí)現(xiàn)直接添加進(jìn)PCR體系中而不影響檢測(cè)結(jié)果。
　　3.用ASMNP分離牛奶中致病菌的基因組DNA，對(duì)分離步驟進(jìn)行了優(yōu)化，確保ASMNP可以從牛奶處理物中分離到盡可能多的目標(biāo)DNA。分別以沙門氏菌與單核細(xì)胞增生李斯特菌為革蘭氏陰性與陽性菌的代表，利用磁珠捕獲結(jié)合 PCR進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度分別為8 CFU/mL與15 CFU/mL。用沙門氏菌與單核

6、細(xì)胞增生李斯特菌同時(shí)污染牛奶，處理之后磁性分離，結(jié)合多重PCR同時(shí)檢測(cè)兩種菌，檢測(cè)靈敏度分別為15 CFU/mL與25 CFU/mL。本研究建立的方法可以實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、以及多種致病菌污染同時(shí)檢測(cè)。
　　4.將氨基修飾的磁性納米粒子表面通過氨基共價(jià)修飾寡核苷酸序列，可以雜交捕獲單鏈序列（如mRNA）。提高雜交捕獲探針表面的寡核苷酸序列數(shù)目的前提條件是納米粒子表面具有大量的氨基基團(tuán)。在本部分實(shí)驗(yàn)中，采用一步法合成了一種表面呈現(xiàn)網(wǎng)狀的

7、富含氨基的磁性納米粒子，這種納米粒子同樣對(duì)磁核具有很好的包被作用，表面氨基數(shù)目顯著提高。在此納米粒子表面修飾上寡核苷酸序列雜交捕獲互補(bǔ)序列，雜交捕獲效率顯著提高。此外，用ARSMNP直接吸附 DNA，效率也顯著提高。
　　5.在ARSMNP表面連接寡核苷酸序列，制備了磁性雜交捕獲探針，并對(duì)探針合成步驟進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)連接臂、偶聯(lián)方式等進(jìn)行了探討。將含有致病菌的牛奶樣品進(jìn)行處理，然后通過雜交磁性捕獲目標(biāo) mRNA，結(jié)合RT-qPCR對(duì)