未培養(yǎng)微生物延胡索酸水合酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)鑒定.pdf

1、延胡索酸水合酶，又稱延胡索酸酶(fumarate hydratase，E.C4.2.1.2)，是催化延胡索酸轉(zhuǎn)變成L-蘋果酸的-類酶。L-蘋果酸在食品、醫(yī)藥、印染和建筑等行業(yè)上有特殊的用途。近幾年來(lái)具有高度耐熱活性產(chǎn)延胡索酸酶微生物，如黃色短桿菌(Brevibacteium Flavum)及短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，被廣泛應(yīng)用于以延胡索酸作底物生產(chǎn)L-蘋果酸。但是目前天然發(fā)酵菌種在工業(yè)生產(chǎn)中存在著延胡索酸水合酶

2、活力不高或者受天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶干擾的難題。宏基因組學(xué)技術(shù)繞開(kāi)了“純培養(yǎng)”的技術(shù)瓶頸，使得人們?cè)诨蚪M水平上直接開(kāi)發(fā)利用各種環(huán)境中豐富的微生物基因資源成為現(xiàn)實(shí)。本實(shí)驗(yàn)室利用宏基因文庫(kù)技術(shù)，構(gòu)建了廣西北部灣海洋沉積物文庫(kù)。利用活性篩選和直接測(cè)序相結(jié)合的篩選策略，得到了一種編碼延胡索酸水合酶的新型酶基因(fumF)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，在氨基酸水平上和一種來(lái)自于Burkholderia（伯克氏菌）菌屬的延胡索酸水合酶同源性為27％，一致性為

3、41％。利用PCR定點(diǎn)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的基因，與表達(dá)質(zhì)粒pETBlue-2連接，導(dǎo)入表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)pLysS，構(gòu)建了重組表達(dá)克隆pGXAM3566G/BL21(DE3)pLysS。SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果表明，目標(biāo)誘導(dǎo)蛋白大小為60kDa左右，與生物信息學(xué)分析結(jié)果基本一致。本工作為進(jìn)一步研究新型延胡索酸水合酶FumF的生化功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究以大腸桿菌表達(dá)菌株pGXAM3566G/BL21(DE3)p

4、LysS的表達(dá)fumF編碼的基因產(chǎn)物主要研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，發(fā)現(xiàn)正向反應(yīng)最適pH值8.5，最適作用溫度55℃的條件下，逆向反應(yīng)受pH值及溫度影響比較小。以延胡索酸及蘋果酸分別作為底物，得出FumF重組蛋白的酶活為6.75U/mg，逆反應(yīng)方向酶活為0.68U/mg。測(cè)定正向反應(yīng)的Km值為0.5228 mM，最大反應(yīng)速度為54μM/min，轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat為9.085 min-l，反相反應(yīng)Km值為4.33 mM，最大反應(yīng)速