湖羊瘤胃未培養(yǎng)微生物中木聚糖酶基因的克隆和表達.pdf

1、環(huán)境宏基因組文庫的構(gòu)建是開發(fā)未培養(yǎng)微生物資源的有效途徑。本研究通過構(gòu)建湖羊瘤胃未培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫，共獲得12，000個克隆，文庫外源DNA總?cè)萘繛?.6×108 bp，篩選得到2個表達內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶活性的克隆。選擇其中表達木聚糖酶活性較強的克隆UMXYL2作為進一步研究的對象。通過亞克隆及測序得到3個木聚糖酶基因UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2和UMXYL2-6-1，分析結(jié)果表明都是新的木聚糖酶基因，為進一

2、步研究木聚糖酶的降解機理及構(gòu)建能降解各種不同飼料來源木聚糖的酶庫打下基礎(chǔ)。 UMXYL2-1-1基因由1086個核苷酸組成，（G+C）含量為53.78％，熔點為86.49℃，可編碼一個含361個氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白預(yù)計分子量為38，974.2道爾頓，等電點pI為8.56。UMXYL2-1-2基因由849個核苷酸組成，（G+C）含量為52.41％，熔點為85.80℃，可編碼一個含282個氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白預(yù)計分子量為31，03

3、9.2道爾頓，等電點pI為8.52。UMXYL2-6-1基因由1278個核苷酸組成，（G+C）含量為50.23％，熔點為85.11℃，可編碼一個含425個氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白預(yù)計分子量為45，777.8道爾頓，等電點pI為8.72。 UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2和UMXYL2-6-1蛋白均為來自糖基水解酶家族11的木聚糖酶，編碼產(chǎn)物都與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌Fibrobacter succinogenes（access

4、ion no.AAA21848.1）的內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶同源性最高，UMXYL2-1-1的編碼產(chǎn)物與其有67％的相似性，UMXYL2-1-2的編碼產(chǎn)物與其有45％的相似性，UMXYL2-6-1的編碼產(chǎn)物與其有62％的相似性，它們可能有著共同的來源。氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)三條序列中間部分相似度非常高，推測該區(qū)域可能為蛋白的活性中心；并且UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2來自同一個陽性亞克隆UMXYL2-1，間隔僅為205bp，

5、推測該木聚糖酶基因可能是以基因簇的形式存在的。系統(tǒng)進化分析也表明UMXYL2-1-1、UMXYL2-1-2和UMXYL2-6-1可能都是來自產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌或絲狀桿菌屬一個未培養(yǎng)的種。 PCR擴增木聚糖酶基因并連接到表達載體pET28a（+）上，將UMXYL2-1-1和UMXYL2-1-2基因分別在BL21中實現(xiàn)了表達。對UMXYL2-1-2蛋白的表達條件和酶學(xué)特性做了初步研究，結(jié)果表明：在25℃條件下誘導(dǎo)最佳，UMXYL2-