大黃魚(yú)TLR5與NF-κB家族部分基因的克隆與功能研究.pdf

1、本研究在實(shí)驗(yàn)室前期獲得大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）兩種類型TLR5(LcTLR5M，LcTLR5S)cDNA序列的基礎(chǔ)上，分別克隆了它們的啟動(dòng)子序列，通過(guò)片段缺失，定點(diǎn)突變等技術(shù)，篩選并驗(yàn)證了其啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn);構(gòu)建了LcTLR5M和LcTLR5S的亞細(xì)胞定位質(zhì)粒，研究了其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)特征;構(gòu)建了它們的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，將其分別以及共同與NF-κB家族p65基因啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，檢測(cè)了LcTLR5M和LcTLR

2、5S過(guò)表達(dá)對(duì)NF-κB-p65啟動(dòng)活性的影響?？寺×舜簏S魚(yú)NF-κB家族RelB基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分析了它的分子結(jié)構(gòu)及組織表達(dá)譜，檢測(cè)了病原相關(guān)分子模式(PAMP)刺激后，其在細(xì)胞系內(nèi)的時(shí)空表達(dá)特征;研究了RelB亞細(xì)胞定位并分析了其過(guò)表達(dá)后對(duì)TNF-α等部分細(xì)胞因子的影響及IκB家族IκB-α對(duì)其調(diào)控機(jī)制。擴(kuò)增了NF-κB家族成員p65基因的啟動(dòng)子序列，檢測(cè)了其活性，以及病原刺激后對(duì)其啟動(dòng)活性的影響;研究了p65基因亞細(xì)胞定位及

3、分析了其過(guò)表達(dá)對(duì)下游細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-I基因的啟動(dòng)子活性的影響，及IκB-α對(duì)其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果如下:
　　(1)大黃魚(yú)TLR5M啟動(dòng)子區(qū)域在-1829bp至+189bp之間，無(wú)CpG島區(qū)域，轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)含有CEBP、Oct-1、GA TA-1、AP1等元件，系列片段缺失分析基本啟動(dòng)子活性所需的順式作用元件可能位于-417至+189之間，負(fù)調(diào)控元件可能位于-799至-417之間。大黃魚(yú)TLR5S啟動(dòng)子區(qū)域在-1

4、932bp至+106bp之間，無(wú)CpG島區(qū)域，轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)含有CEBP、SP1、Oct-1、AP1、NF-B等元件，片段缺失表明TLR5S基因順式作用元件可能位于-808至+106之間，Oct-1和NF-κB結(jié)合位點(diǎn)對(duì)TLR5S啟動(dòng)子活性有正調(diào)控作用且大黃魚(yú)NF-κB家族亞基p65過(guò)表達(dá)可顯著上調(diào)TLR5S啟動(dòng)子活性，表明預(yù)測(cè)正確。亞細(xì)胞定位分析表明，大黃魚(yú)TLR5M蛋白主要定位在細(xì)胞膜上，而TLR5S蛋白主要定位在細(xì)胞漿中。TLR5M

5、過(guò)表達(dá)對(duì)NF-κB-p65啟動(dòng)子的活性無(wú)顯著影響，而TLR5S過(guò)表達(dá)可以顯著上調(diào)NF-κB-p65啟動(dòng)活性。
　　(2)大黃魚(yú)RelB(LcRelB)基因全長(zhǎng)為1946bp，ORF為1788bp，編碼595個(gè)氨基酸，包含RHD-DNA-bind結(jié)構(gòu)域和IPT結(jié)構(gòu)域，等電點(diǎn)pI=5.6，分子量為66.5KDa。進(jìn)化分析表明，大黃魚(yú)RelB基因與紅鰭東方純親緣關(guān)系最近;LcRelB廣泛分布于多種組織，其中在血細(xì)胞中含量最高，其次是脾臟

6、和頭腎，皮膚中含量最低;LPS和poly I∶C刺激后，大黃魚(yú)LCK細(xì)胞系中LcRelB上調(diào)表達(dá)顯著，而PGN免疫刺激后表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。LcRelB蛋白定位于細(xì)胞核中。LcRelB過(guò)表達(dá)后，其下游細(xì)胞因子IL-1β啟動(dòng)子活性顯著下調(diào)，而TNF-α和IFN-I啟動(dòng)子活性顯著上調(diào)(p＜0.05)，而當(dāng)NF-κB家族抑制因子LcIκB-α與其共轉(zhuǎn)染后，可以顯著抑制TNF-α啟動(dòng)子活性(p＜0.01)。
　　(3) Lcp65啟

7、動(dòng)子區(qū)域?yàn)?1695bp至+111bp，預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)含有USF、AP1、SRF、IRF-1、NF-κB等元件，含有CpG島以及(GT)n重復(fù)區(qū)域;LPS，PGN，F(xiàn)lagellin刺激后均能夠顯著誘導(dǎo)p65啟動(dòng)活性上調(diào)，其中Flagellin誘導(dǎo)能力最為顯著(p＜0.01);亞細(xì)胞定位表明，Lcp65蛋白主要定位于細(xì)胞核中;Lcp65過(guò)表達(dá)后能顯著上調(diào)其下游細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-I啟動(dòng)子的活性，其中，TNF-α的