林蘭教授辨治糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床經(jīng)驗(yàn)挖掘及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，該病可嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量、增加糖尿病患者的致殘率和死亡率。目前該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，針對(duì)該病的有效防治藥物也非常有限。林蘭教授對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的防治研究已達(dá)50年，她對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的中醫(yī)病因病理、治療等方面認(rèn)識(shí)非常深刻，創(chuàng)造出了許多獨(dú)特有效的治療方法，糖痛方就是其防治糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床精華之一。本論文在導(dǎo)師林蘭教授“糖尿病三型辨證理論”學(xué)術(shù)思想的指導(dǎo)下，首先對(duì)其防治糖

2、尿病周圍神經(jīng)病變的中醫(yī)辨證論治經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的挖掘和整理，然后以體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用中藥血清藥理學(xué)方法，從細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路探討糖痛方治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的可能分子機(jī)制。
　　一、臨床研究
　　目的:對(duì)林蘭教授治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床病例進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析，總結(jié)林蘭教授對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的中醫(yī)病因病機(jī)認(rèn)識(shí)及其辨證分型和方、藥應(yīng)用特點(diǎn)。為提高林蘭教授經(jīng)驗(yàn)傳承研究的效率及水平，為總結(jié)、提煉和優(yōu)化糖尿病周

3、圍神經(jīng)病變中醫(yī)藥防治規(guī)律提供臨床循證依據(jù)。
　　方法:將2011年1月-2014年1月林蘭教授在廣安門醫(yī)院內(nèi)分泌門診確診的105例糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的470診次的診療病例整理成結(jié)構(gòu)化臨床診療電子病歷。將電子病歷、評(píng)分量表、檢查化驗(yàn)結(jié)果、方藥的全部數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)倉(cāng)庫(kù)，利用多維檢索分析平臺(tái)進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分析DPN患者的一般資料、理化檢查結(jié)果、癥狀和證型特點(diǎn)、林蘭教授用藥特點(diǎn)。
　　結(jié)果:1、DPN患者一般資料統(tǒng)計(jì):105例DP

4、N患者中男性占52.4％、女性占47.6％;無(wú)家族史的占77.1％、有家族史的占22.9％;年齡小于50歲的占14.3％、50-59歲的占32.4％、60-69歲的占28.6％、大于70歲的占24.8％;糖尿病病程小于1年的占3.8％、1-10年的占59.2％、11-20年的占30％、大于20年的占6.7％。2、患者癥狀分析:將患者各個(gè)癥狀按照出現(xiàn)的頻次統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，下肢的感覺和運(yùn)動(dòng)異常癥狀中肢體麻木癥狀出現(xiàn)的最多，其次為肢體發(fā)涼、肢

5、體疼痛、肢體浮腫，而肢體強(qiáng)急或癱軟無(wú)力癥狀出現(xiàn)的最少。從其他癥狀和舌脈證出現(xiàn)的頻次分析，屬于血瘀證、氣虛證的癥狀出現(xiàn)的最多，陰虛和陽(yáng)虛癥狀出現(xiàn)的頻次居中，熱盛的癥狀出現(xiàn)的最少。3、DPN患者證候要素提取的分析:以單一癥狀分析，DPN各類證候中以氣虛證、陽(yáng)虛證、陰虛證最為常見，瘀血證、痰濕證、熱盛證其次。但各證型之間常常相互組合出現(xiàn)，在二證、三證、四證組合中可以看出，出現(xiàn)頻次最多的是氣陰兩虛證，而且在氣陰兩虛基礎(chǔ)上，氣陰兩虛夾瘀證要多于氣

6、陰兩虛夾痰濕證;陰陽(yáng)兩虛證其次，在陰陽(yáng)兩虛的基礎(chǔ)上，陰陽(yáng)兩虛夾痰濕證要多于陰陽(yáng)兩虛夾瘀血證;陰虛熱盛證出現(xiàn)的最少，而且陰虛熱盛夾痰濕證和瘀血證出現(xiàn)的頻次均少于10次。依據(jù)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果推斷DPN的臨床主要證候類型是氣陰兩虛夾瘀證和陰陽(yáng)兩虛夾痰濕證。4、林蘭教授臨床用藥分析:匯總林蘭教授治療的105例DPN患者、470個(gè)診次中使用的所有中藥處方，將處方中所有中藥按照藥物出現(xiàn)的總頻次數(shù)進(jìn)行排序，統(tǒng)計(jì)用藥頻次超過(guò)10次的藥物作為高頻中藥，共選取

7、中藥69味。參考第七版《中藥學(xué)》教材及《中華本草》，將69味高頻中藥按照功效進(jìn)行分類，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，林蘭教授治療DPN使用最多的是補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥，其次為安神藥、收澀藥、理氣藥、化痰藥、化濕藥、平肝熄風(fēng)藥、清熱藥。在補(bǔ)虛類藥物使用時(shí)以補(bǔ)血藥和補(bǔ)氣藥為主，補(bǔ)陰藥和補(bǔ)陽(yáng)藥為次。將69味高頻中藥按照藥物的歸經(jīng)進(jìn)行分類，結(jié)果顯示林蘭教授治療DPN使用的藥物中歸心經(jīng)的藥物最多，其次為肝經(jīng)、腎經(jīng)、肺經(jīng)、脾經(jīng)、胃經(jīng)、大腸經(jīng)、膽經(jīng)、膀胱經(jīng)、心包經(jīng)、小

8、腸經(jīng)、三焦經(jīng)。5、采用Liquorice數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)對(duì)高頻中藥，進(jìn)行基于功效的聚類分析，統(tǒng)計(jì)出了林蘭教授治療DPN的組方配伍規(guī)律，即核心復(fù)方配伍規(guī)律和常用的藥對(duì)配伍規(guī)律。
　　結(jié)論:糖尿病三型辨證理論是臨床辨治糖尿病及其并發(fā)癥的核心理論基礎(chǔ)，糖尿病周圍神經(jīng)病變的辨證論治是在三型辨證理論指導(dǎo)下的擴(kuò)展和延伸。氣陰兩虛是糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病基礎(chǔ)，陰陽(yáng)兩虛是病情加重的重要原因;瘀血、痰、濕是主要致病因素，該病病變涉及五臟系統(tǒng)，癥狀表現(xiàn)

9、復(fù)雜，根據(jù)臨床癥狀特點(diǎn)可將糖尿病周圍神經(jīng)病變分為四型:氣陰兩虛脈絡(luò)瘀阻型、陰陽(yáng)兩虛寒濕痹阻型、肝腎陰虛血不榮經(jīng)型、脾胃兩虛痰瘀互阻型。本課題首次利用結(jié)構(gòu)化臨床診療信息采集系統(tǒng)，最大程度地收集到全面、規(guī)范的病例資料，從“病—癥—證—治—方—藥”等各個(gè)角度對(duì)林蘭教授治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行分析，總結(jié)出了林蘭教授對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的中醫(yī)病因病機(jī)認(rèn)識(shí)及其辨證分型和方、藥應(yīng)用特點(diǎn)。為名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)的繼承和發(fā)揚(yáng)提供了一定的借鑒。

10、　　二、實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:從細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路探討糖痛方治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的分子機(jī)制。
　　方法:本課題從SD乳鼠的坐骨神經(jīng)中培養(yǎng)出雪旺細(xì)胞，并使用含50mM高糖的培養(yǎng)液干預(yù)72h，誘導(dǎo)出雪旺細(xì)胞的凋亡模型。采用cck-8法篩選出糖痛方含藥血清、糖痛方中的主要有效成分鹽酸川芎嗪、黃芪多糖，促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖的最佳濃度，作為干預(yù)雪旺細(xì)胞凋亡的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)共設(shè)立對(duì)照組、高糖組、糖痛方組、川芎嗪組、黃芪多糖組5個(gè)組別，分

11、別采用AⅤ/PI雙染法觀察各組細(xì)胞凋亡率、用TUNE1免疫熒光染色法觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)、用WesternBlot法以及RT-PCR法觀察凋亡相關(guān)基因與因子(bcl-2、bax、Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome C、Fas、FasL、ICAM-1)蛋白和mRNA表達(dá)的變化。從多方面觀察、比較中藥糖痛方及其主要有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用。
　　結(jié)果:1、本實(shí)驗(yàn)采用組織塊培養(yǎng)法、差速貼壁法、低濃

12、度胰酶消化法相結(jié)合，培養(yǎng)出了純度達(dá)85％的原代雪旺細(xì)胞。實(shí)踐證明該方法培養(yǎng)出的原代雪旺細(xì)胞，不僅純度高、活性好而且可重復(fù)性佳，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。2、本實(shí)驗(yàn)采用AnnexinⅤ/PI雙染、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法觀察出不同高糖濃度、不同干預(yù)時(shí)間以及不同細(xì)胞培養(yǎng)密度條件下的雪旺細(xì)胞凋亡情況，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定以50mM的高糖干預(yù)的第48-72h作為雪旺細(xì)胞凋亡模型最適宜。3、采用CCK-8法證實(shí)了糖痛方含藥血清對(duì)高糖導(dǎo)致的雪旺細(xì)胞

13、增殖抑制狀態(tài)有顯著的逆轉(zhuǎn)作用。糖痛方藥物的主要有效成分:黃芪多糖在160mg/L-3200mg/L濃度之間、鹽酸川芎嗪在4mg/L-200mg/L濃度之間時(shí)具有明顯促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖的作用，并且其增殖作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。隨后我們?cè)趦煞N藥物的有效濃度中各選取了高、中、低三個(gè)干預(yù)濃度，將其作用于高糖培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明鹽酸川芎嗪和黃芪多糖有促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖作用，而且這種作用也可以明顯改善高糖對(duì)雪旺細(xì)胞增殖的抑制作用。4、通

14、過(guò)AnnexinⅤ/PI雙染法、TUNE1免疫熒光染色法檢測(cè)了糖痛方及其主要有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)高糖作用72h后雪旺細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，與對(duì)照組相比高糖組和川芎嗪組凋亡最顯著(P＜0.05)，黃芪多糖組、糖痛方組的凋亡率與對(duì)照組相比均增加，與高糖組相比均有顯著降低(P＜0.05)。糖痛方組與黃芪多糖組相比無(wú)顯著差異，與川芎嗪組相比差異顯著(P＜0.05)。5、Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，各干預(yù)組

15、的bcl-2/bax的比值與對(duì)照組相比均顯著降低(P＜0.01)，這表明對(duì)照組細(xì)胞分泌的抗凋亡蛋白占主導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，而其余各干預(yù)組經(jīng)高糖干預(yù)后促凋亡的蛋白過(guò)度表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。經(jīng)高糖刺激后各干預(yù)組Fas、FasL、CytochromeC、Caspase-9、Caspase-3、ICAM-1蛋白表達(dá)量均增加，其中高糖組增加最明顯，與對(duì)照組相比（P＜0.01或P＜0.05），糖痛方組增加最少，川芎嗪組和黃芪多糖組介于兩者之

16、間。6、RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，糖痛方組各種凋亡相關(guān)基因和因子的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異;高糖組與對(duì)照組相比bcl-2mRNA表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-3、ICAM-1mRNA表達(dá)量顯著增高(P＜0.01);川芎嗪組和黃芪多糖組各凋亡相關(guān)基因和因子的mRNA表達(dá)量介于高糖組和糖痛方組之間。
　　結(jié)論:以益氣養(yǎng)陰活血化瘀為主要作用的糖痛方能