ApoBR在布魯氏菌胞內(nèi)寄生中的功能研究.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人畜共患傳染病,人感染布病后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為波浪熱;動(dòng)物感染后主要為流產(chǎn)、睪丸炎等癥狀。布魯氏菌可長(zhǎng)期寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)并抑制感染細(xì)胞的凋亡,引起人、畜的多器官損傷和慢性感染,給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重威脅。因此,對(duì)布魯氏病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究,尋找有效的治療性藥物和有效的疫苗迫在眉睫。
　　目的:在本實(shí)驗(yàn)室黃小強(qiáng)篩選到與布魯氏菌 OMP25互作的宿主蛋白為ApoBR,其在布

2、魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞中的作用并不清楚,為了了解ApoBR的作用而展開(kāi)研究。本文通過(guò)RNAi等技術(shù)探討ApoBR在布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞中的作用,為布魯氏菌逃避巨噬細(xì)胞殺傷作用的機(jī)制和抑制腫瘤壞死因子信號(hào)通路方面的調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)將ApoBR蛋白的基因應(yīng)用siDESIGN Center網(wǎng)頁(yè)設(shè)計(jì)干擾片段并合成,將合成的干擾片段連接到干擾載體pSIREN-RetroQ-ZsGreen上,構(gòu)建10個(gè)干擾載

3、體,通過(guò)qRT-PCR對(duì)干擾載體進(jìn)行初篩,篩選出抑制效果較為明顯的RNAi干擾片段。(2)將初篩獲得的RNAi干擾片段,構(gòu)建 RNAi慢病毒載體 pLentiLox3.7-X( X分別為干擾片段ApoBR-253、ApoBR-893、ApoBR-1325和ApoBR-2053),進(jìn)一步篩選出更高效的RNAi干擾片段。(3)用牛種布魯氏菌S2308侵染高效轉(zhuǎn)染RNAi慢病毒載體的小鼠巨噬細(xì)胞,在4h、8h、12h、24h收集細(xì)胞和上清,細(xì)

4、胞用裂解液裂解,梯度稀釋,進(jìn)行胞內(nèi) CFU計(jì)數(shù),上清用于 ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF-α)的變化。裂解侵染的轉(zhuǎn)染慢病毒載體的巨噬細(xì)胞,提取RNA,應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)促凋亡因子Bax和抑制凋亡因子Bcl-2的變化,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)布魯氏菌侵染的轉(zhuǎn)染慢病毒細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果:(1)測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了10個(gè)干擾載體 pSIREN-RetroQ-ZsGreen-X(X分別為 ApoBR-163、ApoBR-457、

5、ApoBR-648、ApoBR-2668、ApoBR-1138、 ApoBR-893、ApoBR-253、ApoBR-1325、ApoBR-2053、CK)。應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)和生物信息學(xué)分析比對(duì)成功篩選出4個(gè)比較高效的干擾載體pSIREN-RetroQ-ZsGreen-X(X分別為:ApoBR-253、ApoBR-893、ApoBR-1325、ApoBR-2053)。(2)成功構(gòu)建 pLentiLox3.7-253、 pLenti

6、Lox3.7-893、pLentiLox3.7-1325、pLentiLox3.7-20534個(gè)慢病毒載體,并篩選獲得2個(gè)更高效的干擾載體pLentiLox3.7-253和pLentiLox3.7-1325,抑制率高達(dá)60％以上(3)布魯氏菌2308侵染高效轉(zhuǎn)染慢病毒載體的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的CFU結(jié)果與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比CFU降低。ELISA檢測(cè)TNF-α結(jié)果顯示與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比均呈下降趨勢(shì)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的

7、凋亡率結(jié)果顯示,與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,凋亡率均升高,RT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2的結(jié)果顯示,促凋亡因子 Bax相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比均升高,而抑制凋亡因子 Bcl-2的結(jié)果卻相反。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ApoBR是布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞的重要識(shí)別受體之一,對(duì)布魯氏菌的入侵和早期感染具有重要的作用;使用靶向 ApoBR的 RNAi慢病毒載體能有效抑制布魯氏菌在巨噬細(xì)胞中的增殖,ApoBR的表達(dá)導(dǎo)致TNF-a和