布魯氏菌中CRISPRi與CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構建及功能驗證.pdf

1、布魯氏菌病(brucellosis)是一種波及世界的重要的人畜共患病，對畜牧業(yè)造成了嚴重的經濟損失，因為它人畜共患病的特點，也使其成為了人類健康和社會安全的一大威脅。然而，迄今為止，都未能研發(fā)出安全有效的疫苗。布魯氏菌(Brucella)，又稱作布氏桿菌，是造成布魯氏菌病的病原體，要研發(fā)出安全有效的疫苗，對該菌各類基因的功能研究是十分重要的。
　　目前，對布魯氏菌基因的功能研究存在許多困難。一是布魯氏菌生長緩慢，在實驗室穩(wěn)定的培養(yǎng)

2、環(huán)境下，菌體需要生長36-48h才能在平板上長出肉眼可見的菌落。初次分離的野生菌株生長往往更加緩慢。二是布魯氏菌病人畜共患的特征，使得對布魯氏菌的操作變的相當繁瑣和耗時。這些因素都使得對布魯氏菌基因的研究變得格外困難。目前，對布魯氏菌基因功能的研究主要是依靠自殺質粒，通過單交換和雙交換建立基因缺失株，再通過對基因缺失株的研究探索基因功能。但是，該方法耗時長，操作量大，大大增加了科研人員的操作風險，同時也減緩了研究進度。所以，在布魯氏菌中

3、創(chuàng)建一類迅速、精準、有效的基因研究方式是具備重要意義的。
　　CRISPRi與CRISPR/Cas9系統(tǒng)，是近年發(fā)展迅速的領先的基因研究方法。由于其快速、精確、高效的基因編輯效果，馬上成為眾多科學家的研究熱點。當前已普遍用在對多種生物的研究中。
　　為此，本研究中，我們研究了CRISPRi與CRISPR/Cas9系統(tǒng)在布魯氏菌中應用的可行性。首先，我們建立了可在布魯氏菌中復制表達的CRISPRi工作質粒。CRISPRi系統(tǒng)由

4、兩個重要部分組成，具有阻遏目標基因轉錄功能的dCas9蛋白和具有目標基因識別功能的sgRNA。本研究中，我們以布魯氏菌外膜蛋白基因ompl9為靶基因設計sgRNA，對omp19的表達進行下調，評估了CRISPRi系統(tǒng)在布魯氏菌中對基因表達下調的作用。此外，我們又建立了可在布魯氏菌中復制表達的CRISPR/Cas9工作質粒，并利用該表達系統(tǒng)嘗試對布魯氏菌omp19基因進行敲除。主要成果如下:
　　1.利用CRISPRi系統(tǒng)使布魯氏菌

5、外膜蛋白基因omp19表達下調，且下調具有顯著性。
　　成功構建2種可以在布魯氏菌中復制的CRISPRi工作質粒，分別通過組成型表達和誘導型表達的形式表達dCas9蛋白。設計sgRNA，靶定下調omp19基因。將CRISPRi工作質粒轉化布魯氏菌16M感受態(tài)，應用實時熒光定量PCR分析該基因在mRNA水平的表達，通過western blot的方法分析該基因在蛋白水平的表達。結果顯示，omp19基因表達量下調，并具有顯著性。

6、　　2.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功切割布魯氏菌基因組。
　　成功建立了在布魯氏菌中誘導型表達wtCas9蛋白的CRISPR/Cas9工作質粒。設計sgRNA，在omp19基因上對布魯氏菌基因組進行切割。將該質粒轉化至布魯氏菌16M感受態(tài)，結果顯示CRISPR/Cas9成功地切斷布魯氏菌基因組。
　　3.增強了布魯氏菌通過非同源末端連接途徑(non-homologous end joining，NHEJ)的基因修復功能