產(chǎn)1，3-丙二醇克雷伯氏桿菌的基因工程改造.pdf

1、1，3-丙二醇(1，3-PD)是國(guó)際上公認(rèn)的六大石化新產(chǎn)品之一，其主要功能是作為合成聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體。1，3-PD的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1，3-PD具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。 為便于研究，首先確立了在克雷伯氏桿菌和大腸桿菌兩個(gè)體系中，甘油脫水酶(GDHt)、1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)及其同工酶(YQHD)的酶活測(cè)量方法。確定了在緩沖溶液中加入2mmol/L的二硫蘇糖醇DT

2、T可以明顯提高甘油脫水酶，1，3-丙二醇氧化還原酶及其同工酶的測(cè)量準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在功率300w時(shí)，克雷伯氏桿菌和重組大腸桿菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD)能較好保持關(guān)鍵酶酶活的破碎條件均為：總超聲破碎時(shí)間5min，每隔4S破碎1s；酶活較適宜的測(cè)量條件為：GDHt酶活測(cè)定所用磷酸鹽緩沖液的較適宜濃度為0.045mol/L，來(lái)自克雷伯氏桿菌和大腸桿菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD)的GDHt最適宜pH分別為7.

3、2和7；PDOR和YQHD測(cè)定所用碳酸鹽緩沖液的較適濃度為0.1mol/L，來(lái)自克雷伯氏桿菌的PDOR和大腸桿菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD)的YQHD較適宜pH分別為7.2、9；GDHt和PDOR，YQHD酶活測(cè)定的適宜溫度分別為37℃、45℃、45℃。 由于克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)1，3-PD合成途徑中，加強(qiáng)甘油脫水酶基因表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致因NADH供應(yīng)不足使3-羥基丙醛累積，并對(duì)菌體生

4、長(zhǎng)及1，3-PD合成造成負(fù)面影響。為改善Klebsiellapneumoniae1，3-PD合成途徑，利用PCR技術(shù)從大腸桿菌(Escherichiacoli)中擴(kuò)增出以NADPH為輔酶的1，3-PD氧化還原酶同工酶基因yqhD，從克雷伯氏桿菌中擴(kuò)增出GDHt基因dhaB，構(gòu)建了產(chǎn)1，3-PD關(guān)鍵酶基因的串聯(lián)載體pEtac-dhaB-tac-yqhD，并將其轉(zhuǎn)入到野生Klebsiellapneumoniae中。全細(xì)胞蛋白電泳分析顯示Kl

5、ebsiellapneumoniae(pEtac-dhaB-tac-yqhD)中GDHt和PDOR(YQHD)的蛋白表達(dá)量分別比野生Klebsiellapneumoniae高25.2％和17.4％，酶活則分別由0.59U·mg-1和19U·mg-1提高到1.02U·mg-1和32U·mg-1，蛋白含量和酶活的大幅提升，證明dhaB和yqhD在Klebsmllapneumoniae中得到了表達(dá)。 通過(guò)抗生素濃度梯度實(shí)驗(yàn)，確定了Kl

6、ebsiellapneumoniae(pEtac-dhaB-tae-yqhD)進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)基所含硫酸卡那霉素的最低濃度為30mg/L，獲得Klebsiellapneumoniae和Klebsiellapneumoniae(pEtac-dhaB-tac-yqhD)在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，Klebsiellapneumoniae(pEtac-dhaB-tac-yqhD)比野生Klebsiellap

7、neumoniae的乙醇含量略有提高，提高幅度為9.5％，乙酸含量下降了26.5％，而丁二醇含量更是下降了34.0％，主產(chǎn)物1，3-PD提高了25％。乙酸，乙醇和1，3-PD均在反應(yīng)進(jìn)行7h左右開(kāi)始大量生成，而丁二醇則要在第20h左右才開(kāi)始大量生成。進(jìn)一步在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明發(fā)酵培養(yǎng)較適宜的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量采用兩段控制，第一階段轉(zhuǎn)速控制為200r/min，通空氣條件為2.0vvm，7h后轉(zhuǎn)速和通氣量分別降為100r/mi