RA患者外周血中miR-206的表達(dá)及對(duì)Th17細(xì)胞變化的影響.pdf

1、目的:
　　研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Th17細(xì)胞的變化及miR-206的表達(dá)水平，分析miR-206與KLF4（Th17細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子）及Th17細(xì)胞的關(guān)系，初步探討影響RA患者PBMC中Th17細(xì)胞比例變化的因素。
　　方法:
　　1.30例RA患者及21例健康對(duì)照者外周血標(biāo)本取自蘇州市中醫(yī)院。分離RA患者及健康對(duì)照者PBMC，在體外培養(yǎng)

2、體系中加入PMA、Ionomycin和莫能霉素，培養(yǎng)5h后，分別用FITC標(biāo)記抗人CD3 mAb、PE-CY5標(biāo)記抗人CD8 mAb兩種熒光抗體同時(shí)標(biāo)記，細(xì)胞破膜后再用PE標(biāo)記抗人IL-17A mAb進(jìn)行染色。采用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometer, FCM)檢測(cè)CD3+CD8IL-17+(Th17)細(xì)胞的比例。
　　2.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)RA患者與健康對(duì)照者PBMC中Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR

3、C mRNA的表達(dá)情況。
　　3.通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)RA患者血清中抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體的水平，免疫比濁法檢測(cè)RA患者血清中RF因子含量。分別分析患者抗CCP抗體、RF與Th17細(xì)胞比例之間的相關(guān)性。
　　4.分離RA患者組和健康對(duì)照組血漿，ELISA方法檢測(cè)血漿中IL-1β、IL-6和IL-23的水平，比較這三種細(xì)胞因子在RA患者組和健康對(duì)照組之間的差異。
　　5.通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)R

4、A患者組與健康對(duì)照組PBMC中miR-206的表達(dá)情況，比較其在兩組標(biāo)本中的表達(dá)差異。
　　6.通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)RA患者組與健康對(duì)照組PBMC中KLF4mRNA的表達(dá)情況。分析KLF4 mRNA與miR-206、KLF4 mRNA與Th17細(xì)胞比例，以及miR-206與Th17細(xì)胞比例的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)FCM檢測(cè)結(jié)果分析顯示，與健康對(duì)照組相比，RA患者組Th17細(xì)胞的比例明顯升高（0.65±0.4

5、1％ vs2.02±1.05％，p＜0.001）。
　　2.qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，RA患者組PBMC中RORC mRNA表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組(p＜0.01)。
　　3.分別分析抗CCP抗體、RF因子與Th17細(xì)胞比例的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)抗CCP抗體與Th17細(xì)胞比例呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(r=0.7492，p＜0.001)，而RF因子與Th17細(xì)胞比例之間無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.1728，p＞0.05)。
　　4.ELIS

6、A檢測(cè)RA組和健康對(duì)照組血漿中IL-1β（6.58±3.22pg/ml vs4.25±2.60pg/ml）、 IL-6(34.00±22.02pg/ml vs12.62±9.83pg/ml)、IL-23(99.74±38.67pg/ml vs65.22±36.29pg/ml)濃度，結(jié)果顯示這三種細(xì)胞因子在RA組血漿中的含量明顯高于健康對(duì)照組(p＜0.01，p＜0.001，p＜0.01)。
　　5.對(duì)RA組和健康對(duì)照組PBMC中mi

7、R-206進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示RA組PBMC中miR-206明顯低于健康對(duì)照組(p＜0.005)。
　　6.qRT-PCR結(jié)果顯示，RA組PBMC中KLF4 mRNA表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組(p＜0.05)，KLF4 mRNA與miR-206之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=-0.7626，p＜0.001)，與Th17細(xì)胞比例顯著正相關(guān)(r=0.5147，p＜0.05)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-206與Th17細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r=-

8、0.7552，p＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.RA患者PBMC中Th17細(xì)胞比例明顯上升，其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA高表達(dá)，血漿中IL-1β、IL-6和IL-23水平顯著高于健康對(duì)照組，并且外周血中抗CCP抗體與Th17細(xì)胞的比例呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果提示RA患者外周血中Th17細(xì)胞異常增加，并且與疾病程度密切相關(guān)。
　　2.RA患者PBMC中miR-206表達(dá)水平明顯低下，其特異性靶基因KLF4的表達(dá)明