植酸酶分泌型酵母工程菌株的構(gòu)建及活性分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、該研究的目的是克隆植酸酶基因并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建有效分泌植酸酶的酵母工程菌株,為食品添加劑或菌肥的研究奠定基礎(chǔ).首先根據(jù)已發(fā)表的無花果曲霉(A.ficuum)植酸酶cDNA序列設(shè)計出兩端的引物,以無花果曲霉總RNA為模板通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增出含其自身信號肽的植酸酶基因(phyA)序列.為了獲得合適的酶切位點,將獲得的大約1.4kb大小的PCR基因片段克隆進(jìn)T載體,構(gòu)建出中間載體pMP2并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中擴增.然后用限制性內(nèi)切酶KpnI和S

2、phI酶切pMP2,回收1.4kb大小的phyA片段,分別與酵母表達(dá)載體pGL(含α因子)和pYES2連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,篩選出含phyA基因的重組質(zhì)粒pGPA1和pYPA1.用醋酸鋰法將pGPA1和pYPA1轉(zhuǎn)化進(jìn)Ura缺陷型的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae INVSel),篩選獲得含植酸酶基因的酵母菌株.用磷鉬藍(lán)顯色(AMES)法對酵母培養(yǎng)液進(jìn)行酶活測定,在pGPA1酵母培養(yǎng)液上清中沒有測出植酸酶活性,而

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